[发明专利]葡萄糖醛酸转移酶UGT1A3的特异性探针底物及其应用

说明书

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一类葡萄糖醛酸转移酶UGT1A3的特异性探针底物及其应用。

背景技术

葡萄糖醛酸转移酶（Urid ine diphosphate-glucuronosyltransferase,UGT）超家族包含了机体内重要的Ⅱ相代谢酶，催化化合物与辅因子尿苷二磷酸葡糖醛酸（UDPGA）结合，从而增加底物的亲水性，使其能更有效地从尿或胆汁中排出体外，这是机体的一个重要的解毒过程。目前，人体中葡萄糖醛酸转移酶可根据基因序列分为UGT1、UGT2、UGT3和UGT8四个大家族（Drug Metab Rev 2010,42:45-54）。其中，UGT1A3是UGT1A亚家族中的第三号蛋白，主要分布于人体肝脏、胃肠等组织。其底物谱广泛，UGT1A3不仅催化香豆素类、黄酮类、蒽醌类、胺类和一些小分子酚类的代谢；一些含有羧酸基团的药物，尤其是非甾体类抗炎药，也是UGTIA3的底物。此外，UGTIA3还参与内源性甾体雌酮、2-羟基雌酮和鹅去氧胆酸等胆汁酸的代谢（Drug Metab Dispos 2004,32:281-90;Hepatology 2006,44:1158-70.）。因此，UGT1A3的催化活性可直接影响黄酮或甾体、胆汁酸等化合物在机体中的浓度，从而对这些小分子的活性及毒性产生影响。

目前，已经报道的最有可能成为UGTA3的探针底物只有一个，为六氟-1α,25-二羟基维生素D3，但是，UGT2B4和UGT2B7也能参与六氟-1α,25-二羟基维生素D3的葡萄糖醛酸结合反应。由于UGT2B4和UGT2B7在肝脏中的表达量明显高于UGT1A3，严重限制了其在人肝微粒体中的应用。

目前，葡萄糖醛酸转移酶活性的体外评价体系主要包括重组单酶﹑哺乳动物的亚细胞组分﹑新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等（Toxicology in Vitro 2006,135–153），其中已经商品化的重组UGT1A3单酶主要来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、S9成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子（如：UDPGA等）和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的UGT1A3酶活性进行表征。

综上所述，UGT1A3的特异性探针药物的开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一类葡萄糖醛酸转移酶UGT1A3的特异性探针底物及其应用，该特异性探针底物是D环16位具有羟基的蟾蜍甾烯类化合物，与目前已报道的探针/标准底物六氟-1α,25-二羟基维生素D3不同，这类具有16位羟基的蟾蜍甾烯类化合物对UGT1A3具有更高的选择性，在人肝等生物样品中也可用于UGT1A3酶活性的评估与测定，对评估个体样本的酶活差异具有重要意义。

本发明提供了一类葡萄糖醛酸转移酶UGT1A3的特异性探针底物，该特异性探针底物是D环16位具有羟基的蟾蜍甾烯类化合物（bufadienolides），其结构式如图1所示，其中R基团为-OH、-OAc、=O、-OMe中的一种。

本发明还提供的一种利用所述特异性探针底物定量测定生物体系中UGT1A3酶活的方法，采用图1所示的化合物作为底物，通过定量检测单位时间内的底物消除量或其葡萄糖醛酸产物的生成量来测定各生物样品及细胞中UGT1A3酶的活性。具体测定方法为：

——体系中以这类具有16位羟基的蟾蜍甾烯类化合物中的一种作为特异性探针底物；底物浓度选择1-500μM；

——在具有辅因子UDPGA中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间。

——反应时间为10-120分钟，在确保以上底物相应的16位葡萄糖醛酸结合产物达到定量限且底物转化率低于10%时终止反应；

——测定单位时间内底物减少量或葡萄糖醛酸结合产物生成量作为萄糖醛酸转移酶酶活性的评价指标。

其中检测底物减少量或其对应葡萄糖醛酸结合产物生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、质谱、放射性同位素示踪技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱检测。所有检测器包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射性同位素示踪技术、蒸发光散射或电化学光谱检测器中的一种或多种串联。