[发明专利]东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽及其编码序列和应用

说明书

技术领域

本发明属于抗菌肽及其制备领域，特别涉及一种东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽（ranatuerin-2YJ）及其编码序列和应用。

背景技术

抗菌肽又称肽抗生素，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中为适应环境而产生的最早的免疫活性分子，包括对病原微生物起抑制作用的所有肽类物质，具有水解活性的酶类如溶菌酶、壳多糖酶、葡聚糖酶等除外。抗菌肽广泛分布于自然界中各类生物体内，动物中以昆虫、两栖类、哺乳类居多，主要来源于皮肤粘膜、血液、胃肠道、肝、脾等组织器官，具有抗病原体入侵作用。

蛙科动物是自然界中分布最广泛的两栖类动物，遍及世界各地，其皮肤潮湿、裸露，给细菌、病毒等病原微生物提供了良好的滋生和繁衍环境。蛙科动物的皮肤在维持其生存和适应栖息环境中起着重要的作用，为了适应生存环境，蛙科动物的皮肤中分布了种类繁多、分子结构特殊、功能多样的生物活性物质，主要含有生物胺、生物碱、蟾蜍配基和多肽4 大类生物化学成分，形成了一个巨大的生物活性分子资源库和药物资源库。其中，蛙科动物皮肤抗菌肽是抵抗病原微生物入侵先天防御系统中的重要组成成分，根据其结构功能特点被划分为以下类别，即brevinin-1和brevinin-2家族、esculentin-1和 esculentin-2家族、ranalexin 家族、ranatuerin-1和ranatuerin-2家族、temporin家族、palustrin家族、tigerinin家族、japonicin-1 和japonicin-2家族、nigrocin-2家族、dybowskin-1和 dybowskin-2家族、melittin相关肽和Caerulein precursor相关肽。

两栖类动物皮肤抗菌肽一般由10~50个氨基酸残基组成，分子量约1~7kDa，分子表面通常带有正电荷，等电点多大于7，属于碱性阳离子肽。已报道的蛙科动物皮肤抗菌肽的信号肽和酸性前肽的序列十分保守，以前体肽形式转录，最终以成熟肽形式分泌。信号肽有22个疏水氨基酸残基结构，切割位点位于半胱氨酸-谷氨酸残基（Cys-Glu）之间，其主要功能是促使活性肽从细胞内分泌到细胞外。酸性前肽位于信号肽和成熟肽之间，维持活性肽自身的结构稳定、防止酶解，同时也起到调节生物活性的作用。成熟肽位于酸性前肽赖氨酸-精氨酸（Lys-Arg）残基之后，活性肽成熟过程中，信号肽和酸性前肽被分别切除，通过α-螺旋、β折叠、氨基酸修饰等途径，最终由皮肤颗粒腺分泌至体外，介导一系列的生物效应，可以在不损伤正常细胞的前提下对细菌、病毒等病原微生物起杀灭作用。

东北林蛙（Rana dybowskii）广泛分布于中国东北部的林区湿地，包括长白山脉、大小兴安岭地区、张广才岭腹地等。从东北林蛙皮肤分泌物中分离得到了多种具有抑菌、抗病毒活性的抗菌肽，都可形成两亲的α-螺旋结构，其作用机理不同于传统的抗生素，它不是通过抑制细菌代谢过程中某些重要生命物质的合成来杀死细菌，而是直接通过物理方式作用于细胞壁或细胞膜，使细胞内的活性物质泄漏导致细菌死亡，因此该类抗菌肽不会使细菌产生耐药性，有望成为新一代的抗菌、抗病毒和抗癌药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有抗菌活性的东北林蛙皮肤抗菌肽（ranatuerin-2YJ），以及该抗菌肽的编码序列和制备方法及其在制备抗菌药物中的应用。

本发明所采用的技术如下：

一种东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1所述，其分子量为3000.6道尔顿，等电点9.7。

本发明还具有如下特征：

1、一种编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的完整基因，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2所述。

2、基于如上所述的一种编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的完整基因，编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的核苷酸序，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2第124-207位所述。

3、本发明的东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽采用固相化学的方法进行制备，按照标准的Fmoc固相肽合成程序进行人工合成，合成肽经反相HPLC岛津Shim–pack VP-ODS反相色谱柱4.6mm ×150mm纯化，采用乙腈/水/三氟乙酸溶液洗脱，得到的合成肽纯度高达99%

4、如上所述的一种东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽，在制备治疗微生物感染疾病药物中的应用。