[发明专利]一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖动物病原检测领域，更具体涉及一种鲤疱疹病毒2型（Cyprinidherpesvirus 2，CyHV-2）的基因检测试剂盒，适用于水产养殖中鲤疱疹病毒病2型的诊断、进出口检验检疫中鲤疱疹病毒病2型的快速检测。

背景技术

鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）是造成金鱼大量死亡的疱疹病毒性造血器官坏死病（herpesviral haematopoietic necrosis，HVHN）的病原，故也称为金鱼造血器官坏死病毒(goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)。按照国际病毒系统分类委员会的系统命名规则，正式命名为鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）。该病毒于1992年秋季和1993年春季因造成日本西部养殖的金鱼大量死亡而被首次发现，其致死率高达100%。该病随后在美国，中国台湾，澳大利亚和英国相继爆发，给金鱼养殖造成了巨大的经济损失。近年来，我国鲫鱼（异育银鲫）主要养殖区的鲫鱼出现了大规模死亡，死亡率达80%以上，经过电镜观察和分子检测，确定病原为CyHV-2。该病传播范围广、传染性强、发病快、致死率高，已给我国鲫鱼养殖业造成了巨大的经济损失，成为我国水产养殖中危害最为严重的病毒性疾病之一。

细胞培养分离技术是病毒诊断的有效方法，通常是世界动物卫生组织（OIE）推荐的鱼类病毒检测的首选方法。但现有研究资料表明，CyHV-2很难在现有的鱼类细胞系中增殖。胖头鲤细胞（fathead minnow cells，FHM)、鲤鱼上皮瘤细胞（epithelioma papillosum cyprini，EPC)、鳗鱼肾细胞（eel kidney，EK-1）、鲑鱼胚胎细胞（chinook salmon embryo，CHSE-214）、虹鳟鱼性腺细胞（rainbow trout gonad，RTG-2）和罗非鱼卵巢细胞（tilapia ovary，TO-2）均对CyHV-2不敏感。仅锦鲤鳍细胞（koi fin 1，KF-1）能产生特征性的细胞病变效应（CPE），但可惜的是，病毒在KF-1细胞上传至第3代后，CPE消失。可见目前阶段，细胞培养不是CyHV-2诊断的有效方法，基于病毒基因检测的技术就成为了CyHV-2最有效的检测方法。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增技术作为最基本的基因扩增技术，现在广泛应用于分子生物学的各个领域，在病毒鉴定领域也得到了广泛的应用。然而其扩增结果受限于检测对象的模板含量，当模板量很少时，常常获得阴性结果。在鱼病学领域，患病鱼体内的病毒量通常很低，使用传统的常规PCR检测技术通常由于其灵敏度不够而出现假阴性结果，无法满足水产养殖病害诊断以及口岸检疫工作的需要。巢式PCR扩增技术是一种建立在常规PCR技术上的新技术，其设计两套PCR引物（巢式引物）对模板进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，以此扩增产物作为模板用内引物进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的模板很少）因而增加了检测的敏感性，同时又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。目前未见CyHV-2的巢式PCR试剂盒的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供了一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，本发明操作简单，方便快捷，检测限低，灵敏度高，检测结果准确可靠。

本发明以抽提自患病鱼组织的病毒DNA作为PCR扩增模板，用两对嵌套式引物对模板DNA进行扩增，可以在较短时间内完成整个PCR检测，不但极大地提高了检测灵敏度，而且缩短了检测时间，且结果准确可靠，是一种有效的鲤疱疹病毒2型分子生物学检测方法。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种鲤疱疹病毒2型的巢式PCR检测试剂盒，包括盒体，盒内衬垫上放置6个盛有试剂的1.5mL离心管，包括10×反应缓冲液，Taq酶(1U/μL)，引物P1(含CyHV-2P1F、CyHV-2P1R各10μM)，引物P2(含CyHV-2P2F、CyHV-2P2R各10μM)，纯水(分子生物学级)，阳性DNA(10μg/mL)。

所述的10×反应缓冲液的配方为：Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl215mM，dNTPs2mM。