[发明专利]荧光标记多肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及一种荧光标记多肽及其制备方法和应用。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)是一类从组蛋白赖氨酸残基上去除ε-N-乙酰基的酶家族。真核生物中，染色质的基本单位是核小体。核小体由核心组蛋白(H2A，H2B，H3，H4)构成的八聚体、一段146个碱基的DNA片段和连接组蛋白H1组成。核心组蛋白的C端疏水氨基酸位于核小体的内部，N端氨基酸则伸出核小体外，并被各种组蛋白修饰酶进行特异性位点的修饰，包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等。通过对组蛋白赖氨酸残基的修饰并导致组蛋白过乙酰化，组蛋白去乙酰化酶可以调控特定基因的表达并参与各种生理病理过程的调控。

人类组蛋白去乙酰化酶家族共有18个成员，并根据其与酵母组蛋白去乙酰化酶的同源性分成四类，其中一类和二类被认为是“典型的”组蛋白去乙酰化酶，其特点是可以被trichostation A抑制；第三类酶的催化活性依赖于NAD+辅因子的存在，并不受trichostation A的影响；第四类酶(HDAC11)的催化中心保留了和一二类组蛋白去乙酰化酶相同的基团。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂主要通过调节细胞凋亡、诱导活性氧生成、阻止血管生成等作用机制发挥其抗癌作用，并已成为全球抗肿瘤药物的研究的热点。目前只有两种组蛋白去乙酰化酶抑制剂Vorinostat和Romidepsin被美国食品药品监督管理局批准并被用于治疗表皮T细胞淋巴瘤。因此，建立一个准确高效的组蛋白乙酰化酶抑制剂体外筛选平台在此类药物的临床前研发中显得十分重要和急迫。

目前体外筛选组蛋白乙酰化酶抑制剂体外多使用市售试剂盒来完成，其检测是通过两步法来实现的，第一步是将去乙酰化酶和底物孵育，反应去除底物上的乙酰基，第二步是加入特异识别并切割去乙酰基化的底物的酶，并释放出有色或者荧光基团用于检测。这种体外筛选方法成本较高，且由于反应过程需要加入一步酶偶联反应作为显色反应，在筛选过程中容易得到假阳性或者假阴性结果，从而对后续的研发工作带来许多障碍，并不适用于现代医药产业新药研发的需求。

发明内容

本发明的目的，就是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种荧光标记多肽及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种荧光标记多肽，其氨基酸序列为TSRHK(Ac)-CONH₂，该氨基酸序列第五位赖氨酸残基上的乙酰基团可被组蛋白去乙酰化酶识别并切除。

上述荧光标记多肽的制备方法，包括以下顺序进行的步骤：

A、取Fmoc-Lys(Ac)-Rink酰胺4-甲基二苯甲胺树脂(Fmoc-Lys(Ac)-RinkAmide-MBHAResin)置于反应容器中，以N，N-二甲基甲酰胺溶胀树脂，然后用脱保护液反应2次后，抽出脱保护液；

B、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-His(trt)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应；然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

C、向反应容器中加入脱保护液反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

D、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

E、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

F、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(Boc)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

G、向反应容器中加入脱保护液振荡反应2次，然后抽出脱保护液，用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；

H、依次向反应容器中加入N，N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Thr(tBu)-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和N，N-二异丙基乙胺，振荡反应，然后抽出反应液，再用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，抽干；