[发明专利]重组工程介导的定点突变方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种高效的运用重组工程手段实现定点突变的方法。

背景技术

定点突变是指运用分子生物学手段将蛋白质特定位点的氨基酸改变为另外一个氨基酸。由于直接对蛋白质进行操作非常困难，故首先在基因（DNA）水平对碱基进行改变，突变的基因即编码突变的蛋白质。定点突变是研究基因和蛋白质的结构和功能以及获得高品质的催化用酶的重要途径，属于分子生物学研究的常用手段。

自利用dUTP 酶缺陷型菌株进行定点突变的Kunkel法以来，已发展了多种对克隆于载体上的基因的进行定点突变的方法，常用的有以下两种。

 第一种方法是以美国Stratagene公司的定点突变试剂盒所采用方法为代表的寡核苷酸法。具体过程是首先以突变的寡核苷酸和PCR法扩增得到含突变位点的完整质粒，通过DpnI酶切去除甲基化的模板后，将PCR扩增产物转化至大肠杆菌的宿主菌，再筛选得到定点突变的克隆。本方法的缺点是需要PCR扩增较大的载体部分，虽然近年来高保真、扩增大片段的PCR酶类发展较快，但扩增数kb的载体的效率和高保真度仍然不能保证。此外，试剂盒的昂贵价格（1000元以上）也是一个制约因素。

 第二种方法为重叠－延伸PCR（OE-PCR）和克隆相结合的技术。其特点是设计两个互补的、含突变位点的引物。具体过程是首先扩增含突变位点的上游片段和含突变位点的下游片段，随后以两个片段为模板，通过OE-PCR得到含突变位点的融合片段。融合片段的两侧设计有限制性内切酶的酶切位点，酶切融合片段后克隆至同样酶切的载体上，最后通过筛选得到定点突变的重组克隆。本方法的缺点是OE-PCR方法有时候延伸不能进行，而且涉及一系列的基因克隆步骤，即经过限制性内切酶的酶切、与表达载体的连接、连接产物转化表达宿主菌等操作步骤。

其他的方法如大引物法和多重寡核苷酸法一般为上述方法的衍生，具有类似的克隆步骤，均操作烦琐，耗时长，突变率低。

发明内容

为克服上述不足，本发明申请提出了一种基于重组工程的定点突变方法。

重组工程是上世纪九十年代末发展起来的一种利用重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而进行DNA克隆和修饰的基因工程技术。现均利用来源于lambda噬菌体的重组酶Exo, Beta和Gam，Exo为5'->3' DNA外切酶，其作用于双链DNA得到3'端突出的DNA分子；Beta为DNA单链结合蛋白，其结合在突出的DNA分子上保护单链DNA免于宿主单链核酸酶的降解， Beta行使重组酶的活性，即催化单链DNA分子在复制叉处退火而发生同源重组。Gam蛋白可保护外源的双链修饰DNA片段免受宿主双链核酸酶的降解。

本方法的所提出的重组工程介导的定点突变的基本原理是是采用PCR的方法引入突变，再将突变的DNA通过重组工程酶催化的同源重组而获得发生定点突变的重组克隆，以附图的实施例中对克隆在表达载体pET30a(+)中的nanA基因进行定点突变的实验步骤进行说明。

本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

（1）首先以克隆nanA基因的质粒pLS2042为模板，P1和P2扩增得到突变位点之前的50bp同源臂、突变位点和突变位点之后nanA基因片段。以pKD4为模板，P3和P4扩增得到β-内酰胺酶抗性基因(bla)。其次，以上述两个片段为模板，通过OE-PCR，P5和P6扩增得到融合的DNA修饰片段。此DNA修饰片段依次由下列结构组成：与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂；

（2）将克隆靶基因的质粒转化基因染色体的重组工程菌株LS-GR（大肠埃希氏菌CGMCC No. 3192）；

（3）将步骤（1）得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖诱导下表达Red 重组酶基因的步骤（2）的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源臂和质粒上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段取代质粒上两个同源臂之间的片段。直接获得靶位点发生定点突变，原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代的重组克隆。

本发明中所述的靶位点，可以是一个或数个碱基，相应地，突变位点也可以是一个或数个碱基。