[发明专利]奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于奶山羊选育技术领域，涉及奶山羊泌乳量相关miR-196a基因的单核苷酸多态性及其检测和其作为辅助选择标记在奶山羊育种中的应用。

背景技术

我国山羊品种资源丰富，养羊业的历史悠久，羊的存栏数量占世界前列。在广大的农村、牧区及城市郊区发展养羊业有巨大的潜力。山羊业为我们的生活提供了奶、肉、羊毛、绒及皮革等多种生活产品。其中，奶山羊业，投资小，易饲养，见效快，被称为“农家的奶牛”（赵有璋2002）。羊奶具有很高的营养价值，不含过敏原，营养成分均衡，易消化吸收，与人乳蛋白质组成相似，特别适宜于病人、婴幼儿及老年人饮用，因此山羊奶是最符合人类需求的功能性保健食品（Haenlein,2004）。

然而，在我国与其它养殖业相比，奶山羊养殖规模和方式相对落后。近年来，我国奶山羊存栏总数为580万只左右，发展非常缓慢，年产商品奶约占全国总奶量的3%。因此，利用分子育种技术加快良种选育从而发展和提高奶山羊业，这是我国未来奶业发展的重点内容之一，尤其是在“三聚氰胺事件”后对牛奶产业的发展产生严重的负面影响，山羊奶则越来越受到人们的重视。

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的泌乳量和改善乳品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术（SSCP）、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；直接测序技术成本较高。

MicroRNA(miRNA)在转录后水平对基因表达扮演着极其重要的角色。miRNA是一类小的单链内源性非编码RNA，能够与靶mRNA的特定序列结合，通过降解靶mRNA或抑制翻译发挥其重要调控作用(Bartel,2004)。目前研究已经发现miRNA在细胞分化与凋亡、生长发育、糖脂代谢、炎症、免疫应答以及肿瘤发生等多个生理和病理过程中均扮演着关键角色，己有实验证据表明一些miRNAs在乳腺上皮细胞的分化增殖过程中发挥重要的调控作用。

Stefanie等（Stefanie et al.,2009）应用高能量测序的方法研究产后母小鼠乳腺发育相关的miRNA表达变化规律，结果显示miR-196a参考了小鼠产后腺发育的调控。但miR-196a在奶山羊上的研究目前还未见报道。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用，该基因的单核苷酸多态性其检测方便，可以作为辅助选择标记在奶山羊育种中应用，加快良种选育速度和提高种群品质。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括：

在如SEQ ID No.1所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位为C或T的单核苷酸多态性。

一种奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

1）以包含miR-196a基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊miR-196a基因；

所述的引物对P为：

正向引物：CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA；

反向引物：GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT；

2）用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的单核苷酸多态性：

CC基因型表现为265bp条带；CT基因型表现为265，241和24bp条带；TT基因型表现为241和24bp条带。

所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述琼脂糖凝胶电泳为1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

所述将奶山羊miR-196a基因第340位SNP位点的CT基因型作为有效DNA标记。

所述的有效DNA标记为：

CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。