[发明专利]一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物分析和纳米技术领域，特别涉及一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法。

背景技术

蛋白水解酶（protease, proteinase）是催化多肽或蛋白质水解的酶的统称，简称蛋白酶。广泛分部于动物、植物以及细菌当中，种类繁多，在动物的消化道以及体内各种细胞的溶酶体内含量尤为丰富。蛋白酶对机体的新陈代谢以及生物调控起重要作用。

近年来，实验室直接或间接检测酶的方法有较大的发展，特别是直接检测酶活性更是实验医学的研究热点。血浆酶浓度的检测对临床疾病的诊断，病程发展、预后以及疗效的监测和评估等都具有较重要的意义。

酶的直接检测方法主要有发色底物法和荧光适配体法等。但发色底物法成本高、荧光适配体法底物易水解、操作复杂，故适用范围有限。最近，Medintz提出了一种基于量子点的荧光光谱法，可实现凝血酶活性的检测，为酶活性的检测提供了一种新的思路（Medintz I.L., Clapp A.R., Brunel F.M., et al. Nat. Mater. 2006, 5, 581–588）。

毛细管电泳（CE）具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分离方法开发容易等优点，由于具备如此多的优点以及分离生物大分子的能力，CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。尤其是将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管电泳的应用。本试验建立的酶活性分析检测方法，克服了已有方法存在的缺陷，可满足大批量检测需要，适用范围较广，有较高的精确性及较好的稳定性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为了克服现有技术对酶活性检测的不足，本发明提供一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，首先制备一种量子点—多肽复合物，多肽用荧光标记，量子点与荧光分子之间可以产生荧光共振能量转移（FRET）。将量子点与多肽混合后，分别加入不同浓度的酶；然后进行毛细管电泳检测，同时检测量子点和荧光分子标记的多肽通道的荧光强度，将量子点和荧光分子标记的多肽荧光强度的变化换算成酶每分钟切割的多肽浓度作为Y轴，以酶浓度为X轴，曲线拟合得到酶活性检测的参数；其中多肽为含有待测酶识别位点的多肽，其中C端为组氨酸标签序列或半胱氨酸，N端是带负电的氨基酸并用染料分子标记。

本发明方法中所述的毛细管电泳检测中，电泳缓冲液优选为25 mM硼酸缓冲液，pH9.3。所述硼酸缓冲液经0.22μm滤膜过滤。

本发明中所述的染料分子为量子点、TAMRA、罗丹明、Texas Red、Cy3或Cy5，且满足标记生物分子的染料分子与量子点之间可以发生荧光共振能量转移。

本发明方法可用于检测各种水解酶活性，根据不同的酶，多肽为含有相应酶识别位点的多肽。例如检测凝血酶时，所述的多肽为含有凝血酶切序列LVPRGS的多肽。

将酶与量子点—多肽复合物混合后，可根据FRET信号的变化检测酶活性。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短。该方法是对传统酶活性检测技术进行改进，结合多波长荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏酶活性检测技术。

本发明的有益效果是，本发明提供一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法，操作容易，检测灵敏度高，可实现酶活性检测；荧光光谱仪可同时检测多个荧光波长，从而减少了误差，提高了检测的准确性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明所用的量子点—多肽复合物发生荧光共振能量转移示意图。

图2是用量子点—多肽复合物QD?H6-Cy5检测凝血酶酶活性的毛细管电泳图。不同浓度的凝血酶（a, 0 μM; b, 0.034 μM; c, 0.068 μM; d, 0.135 μM; e, 0.27 μM; f, 0.54 μM; g, 1.35 μM）与QD?H6-Cy5在37 ^oC混合10分钟后用毛细管电泳荧光检测，检测波长分别为612 nm（检测量子点）和661 nm（检测Cy5）。H6-Cy5:QD=32, [QD]=0.5 μM.

图3是凝血酶酶活性检测的动力学曲线。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。

本发明一种基于量子点—多肽复合物的荧光毛细管电泳检测酶活性的方法的操作流程如下：