[发明专利]一种检测食品中三聚氰胺含量的ELISA方法

权利要求书

1.一种检测食品中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一：三聚氰胺修饰物的制备；

步骤二：免疫原和包被抗原的制备；

步骤三：三聚氰胺单克隆抗体的制备；

步骤四：建立测定三聚氰胺的酶联免疫吸附分析方法；

步骤五：ELISA对加标样品中三聚氰胺含量的测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤一包括：

1）三聚氰胺半抗原A（Hapten A）的合成

称取2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪（CAAT）加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入对氨基苯甲酸溶于氢氧化钾的无水甲醇中；反应回流5~12小时，直到CAAT反应完全；反应混合物过滤，并用无水乙醇和蒸馏水各洗三次，得到白色粗产物；再用甲醇/二氯甲烷按一定的溶剂比过柱，得到纯品；其反应式如下：

2）三聚氰胺半抗原B（Hapten B）的合成

称取2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪（CAAT）加入反应瓶，用无水乙醇溶解，再加入3-巯基丙酸溶于氢氧化钾的无水甲醇中；反应回流5~12小时，直到CAAT反应完全；反应混合物过滤，并用无水乙醇和蒸馏水各洗三次，得到白色粗产物。再用甲醇/二氯甲烷按一定的溶剂比过柱，得到纯品；其反应式如下：

3）三聚氰胺半抗原C（Hapten C）的合成

称取三聚氰胺溶于吡啶溶液中，加入丁二酸酐，室温搅拌过夜，吹干吡啶，得到白色产物；再用甲醇/二氯甲烷按一定的溶剂比过柱，得到纯品；其反应式如下：

4)Hapten A、Hapten B和Hapten C的表征：

¹H-NMR谱：用Bruker AMX-400核磁共振仪测试Hapten A、Hapten B和Hapten C的核磁谱，以氘代二甲亚枫溶液为溶剂，内标为TMS；

Hapten A:¹H NMR(DMSO-d6,δvs TMS):2.09(s,2H),6.09(s,4H),7.77-7.91(t,4H),9.2(s,1H).

Hapten B:¹H NMR(DMSO-d6,δvs TMS):2.64(t,2H),3.14(t,2H),6.9(br,4H).

Hapten C:¹H NMR(DMSO-d6,δvs TMS):2.21,3.20(t,2H),6.49(s,4H);9.67(s,1H)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤二包括：

分别称取Hapten A或Hapten B，或Hapten C和二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，一同溶解于二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5~20分钟，取上层清液，缓慢加入到0.01~0.02%的牛血清白蛋白即BSA和0.01~0.02%卵清白蛋白即OVA，搅拌1~10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，Hapten A-BSA、Hapten B-BSA和Hapten C-BSA为免疫原；Hapten A-OVA、Hapten B-OVA和Hapten C-OVA为包被抗原,即分别是包被抗原A、包被抗原B和包被抗原C。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤四包括：

(1)溶液配制；

(2)间接竞争ELISA步骤；

(3)ELISA的优化条件和灵敏度；

(4)ELISA的标准曲线；

(5)ELISA的特异性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述（1）溶液配制包括：

(a).碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；

(b).磷酸缓冲液；

(c).酪蛋白溶液；

(d).磷酸缓冲液-吐温储备液；

(e).底物溶液；

(f).H₂SO₄溶液；

(g)RPMI-1640培养液。