[发明专利]鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。

背景技术

H9亚型禽流感病毒是一种低致病性的流感病毒，1994年H9N2亚型AIV在我国广东被首次分离，十几年来，H9亚型禽流感在我国呈上升趋势，特别是在并发或继发细菌感染时，可造成严重的经济损失。目前H9亚型AIV在我国广泛存在，是影响我国养禽业的主要AIV亚型。严重影响我国养禽业的发展。H9亚型AIV除了感染禽类以外，还可使人受到感染。因此，建立一种针对H9亚型禽流感病毒的的检测方法，既可以对H9亚型禽流感病毒快速、准确地鉴定，又可以用于H9亚型禽流感病毒的流行病学调查。

传统的血凝抑制试验(HI)对H9亚型AIV的鉴定需要多种亚型的血清和抗原，费时费力，不能及时做出诊断或对病毒进行鉴定。目前还没有针对H9亚型流感病毒进行检测的实用的分子生物学方法。本发明所提供的PCR引物对可用于H9亚型AIV引起疾病的快速诊断，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。

本发明所提供的PCR引物对，由两条单链DNA组成，所述两条单链DNA是序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的单链DNA。

本发明所提供的PCR引物对，可用于制备鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒试剂或试剂盒，或用于制备诊断或辅助诊断H9亚型禽流感病毒试剂或试剂盒。

含有所述的PCR引物对的试剂或试剂盒均属于本发明的保护范围。

所述的PCR引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括将所述的PCR引物对中的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

所述鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体包括如下步骤：将所述的PCR引物对中所述的两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内：DNA聚合酶和4种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)。

本发明所提供的引物对的应用中PCR反应体系及最佳循环条件也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的PCR引物对可用于检测H9亚型禽流感病毒。

本发明所提供的PCR引物对可用于检测不同来源的H9亚型禽流感病毒，尤其适合检测鸡源的H9亚型禽流感病毒。

本发明所提供的PCR引物对用于检测H9亚型禽流感病毒特异性强，灵敏度可达1×10^4.25EID50/100μL。与病毒的血凝抑制试验等常规方法相比，鉴定结果符合率为100％。为H9亚型AIV的鉴定提供了一种快速、特异、敏感的检测手段，可用于H9亚型AIV引起疾病的快速诊断，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明引物对H9亚型AIV RT-PCR扩增结果。其中，M为Trans DNA MarkerI；1为H9N2亚型禽流感病毒，2为空白对照。

图2为本发明引物对H9亚型AIV RT-PCR的特异性。其中，M：Trans DNA MarkerI；1：H9N2亚型禽流感病毒；2：鸡新城疫病毒；3：H3N8亚型禽流感病毒；4：H4N6亚型禽流感病毒；5：H5N1亚型禽流感病毒；6：鸡传染性喉气管炎病毒；7：鸡传染性支气管炎病毒；8：鸡传染性法氏囊炎病毒。

图3为本发明引物对H9亚型AIV RT-PCR的灵敏度试验。M：Trans DNA MarkerI；1-5：分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释度的H9亚型禽流感病毒的样品，病毒含量依次为1×10^7.25EID50/100μL、1×10^6.25EID50/100μL、1×10^5.25EID50/100μL、1×10^4.25EID50/100μL、1×10^3.25EID50/100μL。

图4为本发明所提供引物的应用。M：Trans DNA Marker I；1-10为中国农业大学动物流感研究室分离鉴定的H9N2亚型AIV。11-18为H9N2亚型AIV病鸡组织接种鸡胚所得的尿囊液。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。