[发明专利]基于基因组简化与二代测序DNA文库构建方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法及试剂盒，具体是一种基于基因组简化与二代测序DNA文库构建方法及试剂盒。

背景技术

随着分子生物学、遗传学、统计基因组学等学科的不断发展，在基因组(Genome)层面利用全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)等方法研究与人类疾病及家畜重要农业经济性状相关的遗传变异成为可能，单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是GWAS及许多研究工作例如基因组选择(Genomic selection)、高精度遗传作图(Highly-resolution mapping)的基础。对于位点较少的SNP检测，比如少数几个候选基因(Candidate genes)或几个感兴趣的区域以及已知的少数靶SNP位点，许多方法如RT-PCR，IlluminaGoldenGate，SequenomMassARRAY，Applied BiosysetemsSNaPshot以及Roche LightTyper等均能实现小群体样品检测。基于微阵列SNP检测芯片(Affymetrix，Illumina及Agilent等)的出现促进群体遗传学研究，大大提高了SNP检测通量，使在相对较大的群体研究成为了可能，在人上发现了大量与复杂疾病等表型关联的SNP，同时在重要经济动物诸如猪，牛等经济性状研究中发挥了重要作用。但是，相对高的检测费用严重制约了基于芯片研究的广泛应用，同时基于特定群体设计的微阵列芯片并不能满足研究的需要，例如基于长白、大白、皮特兰和杜洛克猪设计的Illumina porcineSNP60芯片(大约6万个SNP位点)，由于中国地方猪种与西方猪种的遗传距离较远，因此在利用该芯片研究地方猪种时存在明显缺陷，SNP位点也嫌不足。跟据研究目的自定制芯片虽能满足研究，但仍然存在大量的时间、劳动力和成本消耗。

二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)的出现革命化了群体遗传学研究，随着其技术不断更新，其研究成本正不断降低，利用二代测序技术在全基因组层面通过并行测序模式(Parallel sequencing)以低检测费用发现数十万甚至百万SNPs成为可能，并以此发现了大量与复杂疾病相关以及与动物表型相关的主效基因(Major effect gene)及SNP位点。基于二代测序个体间数据的不均一性及数据高缺失率的特点，测序方法的改进即测序文库的构建(Libraries preparation)及数据填补方法即基因型推演(Genotyping imputation)是当前研究的难点和热点。当前，用于二代测序的文库构建方法主要有RAD-seq(Restriction-site-association DNA sequencing)(Baird N.J.，et al，2008)、WGR(Whole genome resequencing)(Huang X.H.，et al，2009)、GBS(Genotyping by sequencing)(Elshire R.J.，et al，2011)以及MSG(MμL tiplexedshotgun genotyping)(Andolfatto P.，et al，2011)等，这些方法已分别成功运用到棘鱼(Stickleback)、水稻(Rice)、大麦(Barley)和玉米(Maize)以及果蝇(Fruit fly)等物种的SNP发现(SNP discovery)及基因分型(Genotyping)研究。由于这些物种均为“小”基因组(Small genome)和重组近交系(Recombinant inbred lines)群体，且有较高质量的参考序列(Reference panel)，因此，在较低测序深度(Sequencing depth)和覆盖度Coverage)时能够通过直接分型(Directly genotyping)和间接分型(Imputating genotyping)发现大量的标记。然而，对于来源于远交群体(Outbreeding popμLation)的二倍体杂合物种，特别是系谱不清晰、低质量参考序列以及无单体型图的物种，比如猪，这些方法并不完全适合用。

发明内容