[发明专利]高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法

说明书

技术领域

本发明属于制药领域，特别涉及一种高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法。 

背景技术

单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(Monosialotetrahexosylganglioide Sodium，GM1)的制法一般分为提取和纯化两个步骤。纯化方法大致包括： 

1、CN1814610A公开了采用大孔树脂分离单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法。 

2、CN1353112A公开的纯化步骤为：粗品经离子交换柱层析，反相柱层析，所得GM1纯度大于98％。 

3、CN1158295C公告了结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads及DEAE Sephadex A25柱层析、高效液相色谱层析技术，纯度达95％以上。 

4、Momoi TaKashi建立了阴离子交换层析技术、亲和层析技术。 

现有技术都立足于提高产品纯度、收率，降低产品成本，减少毒害有机溶剂(特别是氯仿)的使用量等方面进行了大量的研究，并且市场已有单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液、注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂钠等多种产品在销售使用。然而，由于来源于生物原料猪脑，单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的不良反应比较多，特别是与药物中的杂质、污染物、添加剂、病毒或特殊代谢产物形成有关的过敏反应，严重的过敏反应可发生全身皮疹，尤其是黏膜处更多，且有溃烂。 

发明内容

本发明提供了一种高纯度的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法，该制法获得的产品具有纯度高、不良反应低的特点。本发明的技术方案包括如下内容： 

本发明的一种高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂钠的制法，是以新鲜猪脑为原料经过提取步骤和纯化步骤进行制备，其中， 

提取步骤包括制丙酮粉步骤、组织总脂的抽提步骤、folch分配步骤、脱病毒步骤、酸水解病毒灭活步骤； 

纯化步骤包括脱盐步骤、硅胶层析步骤、反相层析步骤、浓缩步骤、丙酮重结晶步骤、冻干步骤。 

优选的本发明提取步骤包括， 

制丙酮粉步骤：即将新鲜猪脑捣碎，于-5--15℃用丙酮处理，得沉淀，在70-90℃烘烤，制得丙酮粉； 

组织总脂的抽提步骤：即将丙酮粉以体积比3∶1-1∶3的氯仿甲醇混合液提取2-5次，得抽提液； 

folch分配步骤：即将抽提液用0.05-0.15体积的水进行folch分配，有机层弃去，保留水层，得上清液； 

脱病毒步骤：将上清液加氢氧化钠1-10重量份，于室温下水解3-7小时，醋酸中和至pH7-9，用截留分子量为3000-50000的分子膜截留，得滤液；最优的为截留分子量为30000-50000的分子膜. 

酸水解病毒灭活步骤：将滤液用醋酸调节pH至3.5-4.5，于50-70℃水解8-12小时(巴氏灭菌法)，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。 

最优的本发明提取步骤包括， 

制丙酮粉步骤为：将新鲜猪脑捣碎，于-10℃用丙酮处理，得沉淀，在80℃烘烤，制得丙酮粉； 

组织总脂的抽提步骤为：将丙酮粉以体积比2∶1的氯仿甲醇混合液提取3次，得抽提液； 

folch分配步骤为：将抽提液用0.1体积的水进行folch分配，有机层弃去，保留水层，得上清液； 

本发明的“Folch分配法”是指以二氯甲烷/甲醇液液相分离法来提取脂质的方法。 

脱病毒步骤：将上清液加氢氧化钠5重量份，于室温下水解5小时，醋酸中和至pH8，用截留分子量为3000-50000的分子膜截留，得滤液； 

酸水解病毒灭活步骤：将滤液用醋酸调节pH至4，于60℃水解10小时，采用巴氏灭菌法，水解液冷却，用氢氧化钠调pH至中性，离心，干燥，得总脂粗品干粉。 

优选的本发明各项纯化步骤为： 

脱盐步骤：以HI PREP^TM柱脱盐，214nm紫外监测，电导率监测，水平衡后，将总脂粗品干粉上柱，用水洗脱，收集紫外峰部分，得水相收集液； 

本发明中，HiTrap^TM、HiLoad^TM和RESOURCE^TM均可作为HIPREP^TM柱的替代。 

硅胶层析步骤：体积比为3-9∶1-3∶0.1-0.3的氯仿、甲醇、水混合液平衡硅胶柱，将水相收集液上柱后，用上述氯仿、甲醇、水混合液洗脱，TLC检测收集洗脱液，得收集液；