[发明专利]柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法，特别涉及利用经过密码子优化的柯萨奇病毒B3型P1（VP1、VP2、VP3和VP4）基因，通过酵母表达系统制备柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的方法及其应用。

背景技术

病毒性心肌炎（vital myocarditis，VMC）是由多种病毒引起心肌的非特异性炎症病变，病程较长，数月可康复，其中少数病人会转变成慢性。能引起病毒性心肌炎的病毒中，最普遍的是肠道病毒与腺病毒（Yajima T，Knowlton KU.Viral myocarditis:from the perspective of the virus.Circulation.2009,119(19):2615-2624.），而肠道病毒中的柯萨奇病毒B3（Coxsackievirus B3，CVB3）是其主要病原体（Yuan J,Yu M,Lin QW et al.Th17 cells contribute to viral replication in coxsackievirus B3-induced acute viral myocarditis.J Immunol.2010,185(7):4004-4010.）。在心肌炎与其晚期即扩张型心肌病病例中，有5-50%是由CVB3感染引起的（Maisch B,Ristic AD,Hufnagel G，Pankuweit S.Pathophysiology of viral myocarditis:the role of humoral immune response.Cardiovasc Pathol.2002；11:112-22.）。

另外，柯萨奇病毒B3型与很多人类其它疾病相关，无菌性脑炎与胰腺炎，并且调查显示CVB或许与胰岛素依赖型糖尿病的发病相关（Andreas Henke,Nadine Jarasch and Peter Wutzler.Coxsackievirus B3 vaccines:use as an expression vector for prevention of myocarditis.Expert Rev.Vaccines.2008,7(10),1557-1567.）。

柯萨奇病毒B3型属小RNA病毒，其毒粒为二十面体形，立体对称，呈球形状，是裸露的核衣壳，直径约为23-30nm，无包膜。病毒基因组为约7kb的单链RNA，其组成从5’端到3’端的方向依次为5’端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。P1区编码病毒的主要结构蛋白，即衣壳蛋白（capsule protein），其转录及翻译产物经蛋白酶水解后，最终得到4个蛋白产物，分别为VP4（1A），VP2（1B），VP3（1C）及VP1（1D）。主要的中和抗原位点就在P1区的VP1上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原决定簇，但它们存在的区域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣壳的外表面，所以不具有中和性抗原决定簇。P2区呈现P2A、P2B和P2C三个部分。P2A蛋白的这一区域是起抑制宿主细胞mRNA转录作用的。P2B的功能与转膜作用有关，而P2C蛋白据推测其参与病毒RNA基因组的复制。P3区中，VPg（P3A）前体通过加工成为成熟的VPg。P3C是一个蛋白酶，可以自动催化自我剪切释放。3D是一个RNA合成酶，是在RNA复制过程中的依赖RNA的RNA多聚酶，它可以复制合成病毒的RNA。

研究人员已采用多种方法研究相关疫苗，并且利用动物模型证明了其预防急性感染或心肌炎的潜能，其中包括亚单位疫苗，灭活病毒疫苗，减毒活疫苗或DNA疫苗。然而，这些方法存在危险性，甚至存在不能刺激机体产生理想的免疫反应的可能。例如，减毒或灭活病毒疫苗存在逆转成有毒力的形式的危险或者不完全灭活，将导致接种者患病。目前，还没有预防感染CVB3的特效药或疫苗上市，因此，研制CVB3预防性疫苗对于控制病毒性心肌炎的流行具有重要意义。而病毒样颗粒在形态上和真实的病毒类似，并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以病毒样颗粒为抗病毒预防性疫苗的开发提供了理想的备选方案。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种柯萨奇病毒B3病毒样颗粒的制备方法。并且本方法可应用于柯萨奇B型病毒（B1-B6）的病毒样颗粒制备。

本发明所提供的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法具体可包括如下步骤：