[发明专利]柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法及其应用

权利要求书

1.柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1）将柯萨奇病毒B3型的VP1基因和VP4基因克隆到目的质粒1中，得到重组表达载体1，将VP2基因和VP3基因克隆到目的质粒2中，得到重组表达载体2；

2）用步骤1）得到的重组表达载体1和重组表达载体2共转化目的酵母细胞，得到表达所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重组酵母细胞；

3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型柯萨奇病毒B3型VP1蛋白、野生型柯萨奇病毒B3型VP2蛋白、野生型柯萨奇病毒B3型VP3蛋白和野生型柯萨奇病毒B3型VP4蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型柯萨奇病毒B3型VP1基因、野生型柯萨奇病毒B3型VP2基因、野生型柯萨奇病毒B3型VP3基因和野生型柯萨奇病毒B3型VP4基因的密码子均替换为酵母细胞偏好的密码子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的核苷酸序列分别为序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的酵母细胞为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述VP1基因和所述VP4基因在所述重组表达载体1中各由一个启动子驱动转录，驱动所述VP1基因的启动子方向和驱动所述VP4基因的启动子方向相反；所述VP2基因和所述VP3基因在所述重组表达载体2中各由一个启动子驱动转录，驱动所述VP2基因的启动子方向和驱动所述VP3基因的启动子方向相反。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体1为将所述VP1基因和所述VP4基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处，得到的所述VP1基因和所述VP4基因各由一个启动子驱动转录的重组质粒；所述重组表达载体2为将所述VP2基因和所述VP3基因分别插入到pESC-HIS的两个多克隆位点处，得到的所述VP2基因和所述VP3基因各由一个启动子驱动转录的重组质粒。

7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。

8.密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的VP1基因，其特征在于：所述VP1基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示；或

密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的VP2基因，其特征在于：所述VP2基因的核苷酸序列为序列表中序列3所示；或

密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的VP3基因，其特征在于：所述VP3基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示；或

密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的VP4基因，其特征在于：所述VP4基因的核苷酸序列为序列表中序列5所示。

9.含有权利要求8所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中至少一种的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

10.权利要求8所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中至少一种在制备下述a）或b）产品中的应用：

a）柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒；

b）以柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。