[发明专利]产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

N-乙酰神经氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid，Neu5Ac）是唾液酸家族中最有代表性的成员，由9个碳原子组成的吡喃糖，具有广泛的生物学功能，在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值，具有广泛的应用前景和较高的市场价值，特别是在流感（包括禽流感H5N1和2009年的H1N1）的预防和治疗方面有良好的效果。

目前，N-乙酰神经氨酸的来源有限，工业化生产研究较少，传统的生产方法导致其价格昂贵，大大限制了相关的研发和应用。N-乙酰神经氨酸可从天然物质（比如燕窝、牛奶或者禽蛋）中提取，但由于含量低，分离纯化工艺复杂，N-乙酰神经氨酸产量低、纯度也极低，因此难以用于大工业化生产。由于N-乙酰神经氨酸及其衍生物结构复杂，化学合成法合成N-乙酰神经氨酸需要繁多的保护和去保护步骤，反应条件苛刻，需要铟等贵重金属作为催化剂，并形成大量的中间产物，分离过程复杂困难，造成N-乙酰神经氨酸价格昂贵。自1957年Barry和Goebel首先在大肠杆菌K-235中发现聚唾液酸后，人们陆续在脑膜炎奈瑟菌、沙门氏菌中发现聚唾液酸，聚唾液酸是N-乙酰神经氨酸的同聚物，经酸水解或者酶水解后，分离纯化可得N-乙酰神经氨酸，微生物发酵产聚唾液酸，容易实现规模化，在唾液酸生产中占据了重要的地位，但存在酸水解对环境不友好、酶解成本较高的问题。N-乙酰神经氨酸可通过酶法合成，N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（Neu5Ac lyase or Neu5Acaldolase,NanA，EC4.1.3.3）作用下生成N-乙酰神经氨酸。但是ManNAc的价格昂贵，难以适用于工业化生产。研究发现，GlcNAc-2-异构酶（GlcNAc 2-epimerase，AGE，EC5.1.3.8）可催化GlcNAc异构化生成ManNAc。通过GlcNAc-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶两步酶法反应实现Neu5Ac的生产。GlcNAc异构化生成ManNAc的酶反应需要ATP作为激活剂，导致酶法合成成本高。近几年来，研究人员将重组表达GlcNAc 2-异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶(或N-乙酰神经氨酸合成酶)的两种大肠杆菌细胞作为生物催化介质，生物转化GlcNAc生产Neu5Ac。这种方法不用分离纯化酶，同时由于细胞膜的保护，酶相对更稳定，辅助因子容易再生。但由于需要分别培养两种表达不同酶的菌，将菌体浓缩后进行混合，这种模式难以工业化，同时底物和产物多次进出细胞，受到细胞壁的屏障，从而影响了催化反应效率和转化率。

从以上几种合成N-乙酰神经氨酸的方法可以看出，现有生产方法产量低，成本高，难以规模化扩大，导致Neu5Ac的生产力水平低下，难以满足未来市场需求。迫切需要利用工业生物技术构建代谢工程菌，实现Neu5Ac的经济高效生产。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌方法。

本发明所提供的制备产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌方法，包括如下步骤：将与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因导入宿主菌得到产N-乙酰神经氨酸的重组菌；所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因为N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因。

所述宿主菌为大肠杆菌或所述大肠杆菌的基因敲除突变体；

所述基因敲除突变体为将大肠杆菌中N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶编码基因中的至少一个基因敲除后得到的。

所述N-乙酰神经氨酸转运蛋白的Genbank protein id:AAC76256.2；VERSION GI：87082231；公开日：2011.09.01；

所述N-乙酰甘露糖胺激酶的Genebank protein id:AAC76254.2；VERSION GI：87082230；公开日：2011.09.01；

所述N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶的Genebank protein id:AAC76255.1；VERSIONGI：1789617；公开日：2011.09.01。

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下1）-10）中任一所示：

1）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；