[发明专利]产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种制备产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌方法，包括如下步骤：将与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因导入宿主菌得到产N-乙酰神经氨酸的重组菌；所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因为N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述宿主菌为大肠杆菌或所述大肠杆菌的基因敲除突变体；

所述基因敲除突变体为将大肠杆菌中N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶编码基因中的至少一个基因敲除后得到的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下1）-10）中任一所示：

1）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示；

2）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；

3）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；

4）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；

5）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示；

6）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由1）衍生的蛋白质；

7）将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由2）衍生的蛋白质；

8）将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由3）衍生的蛋白质；

9）将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由4）衍生的蛋白质；

10）将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由5）衍生的蛋白质。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；

所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶为如下a）或b）或c）或d）或e）所示：

a）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列8所示的DNA分子或与序列表中序列8所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

b）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列9所示的DNA分子或与序列表中序列9所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

c）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列10所示的DNA分子或与序列表中序列10所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

d）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列11所示的DNA分子或与序列表中序列11所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子；

e）所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因为序列表中序列12所示的DNA分子或与序列表中序列12所示的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的DNA分子。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述与N-乙酰神经氨酸合成相关的基因是通过权利要求9或10所述的重组载体导入宿主菌的；

所述宿主菌为大肠杆菌K12或大肠杆菌K12ΔnanT或大肠杆菌K12ΔnanK或大肠杆菌K12ΔnanTEK；

所述大肠杆菌K12ΔnanTEK为在大肠杆菌K12中敲除了N-乙酰神经氨酸转运蛋白编码基因、N-乙酰甘露糖胺激酶编码基因和N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶编码基因得到的基因工程菌。

6.由权利要求1-5中任一所述的方法制备得到的基因工程菌。

7.权利要求6所述的基因工程菌在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。