[发明专利]血液细菌内毒素检测试剂盒的制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，尤其是涉及一种用于体液细菌内毒素检测的特异性鲎试剂和血液细菌内毒素检测试剂盒。

背景技术

鲎试剂，是一种是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的生物检测试剂，由于生物活性高、使用方便、安全，因此其主要用作注射药品、生物制品、放射性药品、血液透析液、透析用水、血液保养液和医疗器具（输、注器具）的细菌内毒素检测，为确保药品质量和用药安全发挥了积极作用。

细菌内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂质A成分和微量蛋白的复合物，细菌内毒素分子是一种双糖结构的酰胺类脂复合物，其分子量一般在2000-2300之间。因分子量小，极易从肠系膜或组织液侵入，随血液进入循环系统。内毒素进入机体后作用于体温调节中枢引起发热而影响机体生理病理反应等。细菌内毒素不等同于活细菌，它是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的致热原质。

在二十世纪90年代以来，在医院临床也有学者用鲎试剂检测人体血液细菌内毒素的研究，试图将细菌内毒素检查法应用到人体液的检查，以辅助疾病诊断。但是，由于人或动物血液成分对鲎试剂（TAL或LAL）与细菌内毒素反应具有强干扰性，如，纤维蛋白原、抗凝血酶、纤维蛋白酶抑制剂、胆红素等成分，可对鲎试剂的凝胶反应产生增强或抑制作用。同时，（1,3）-β-D-葡聚糖可激活普通鲎试剂中的G因子而发生旁路反应，引起凝集反应而造成细菌内毒素检测出现假阳性结果。因此，一直以来因普通鲎试剂对体液细菌内毒素和葡聚糖成分的分辨率差，使得细菌内毒素与鲎试剂的专属性反应无法鉴别。而且，由于缺乏一种可行的体液细菌内毒素与葡聚糖的快速分离提取方法，使该技术成为当今世界医学卫生领域的一道难题。

发明内容

本发明为了弥补现有普通鲎试剂的不足，提供一种特异性鲎试剂及其制备方法，和含有该特异性鲎试剂的血液细菌内毒素检测试剂盒，及将它们应用于血液样本中的细菌内毒素检测的检测方法。本发明提供的特异性鲎试剂及检测试剂盒，可以定性鉴别鲎试剂与细菌内毒素和葡聚糖类物质的凝胶反应，从而提高血液细菌内毒素检测结果的可靠性，实现对血液细菌内毒素的定量检测；采用它们进行血液细菌内毒素的检测具有灵敏度高、检测结果可靠和检测效率高的特点。

本发明提供的特异性鲎试剂的制备方法，包括以下步骤：

一种特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A.采血，加入与鲎血的体积比为1:6～1:10的抗凝剂；

B.分离细胞：将鲎血移至离心瓶内，在750-850转/分的速度下离心分离，弃血清；

C.裂解细胞：将步骤B余下的鲎血细胞移至收集瓶内，按鲎血细胞体积的40%-50%的量加入细胞裂解液，裂解细胞得鲎血细胞溶解物；

D.分离细胞壁：按照与鲎血细胞溶解物的体积比为1:0.8～1:1.2的量向鲎血细胞溶解物中加入氯仿，并加入适量聚乙二醇8000，随即混合形成混合溶液，然后离心，分离提取物，制得鲎试剂原液。

E.加入促活剂及G因子抑制剂，配制半成品：按鲎试剂原液体积与促活剂体积比为1:0.15～1:0.30的比例加入预先调配好的促活剂，按照鲎试剂原液体积与G因子抑制剂体积比为1:0.25～1:0.50的比例加入G因子抑制剂，搅匀，制成鲎试剂半成品。

F.灌装、冷冻干燥和封口，制得特异性鲎试剂成品。

所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤A中的抗凝剂是这样配制的：向适量纯化水中加入预配好的辅料溶液，使每100ml溶液中含咖啡因或茶碱0.015M～0.04M，含NaCl0.15M～0.35M。

所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤C中的细胞裂解液是这样配制的：向纯化水中加入0.05M/ml的Tris-HCl溶液，调PH值为6.0～8.0。

所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤D中的聚乙二醇8000在所述混合溶液中的浓度为1.5～3mg/ml。

所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤E中的促活剂是这样配制的：在适量纯化水中加入KCl、MgSO₄或CaCl₂溶液，使每毫升促活剂含KCl 0.15～0.30M，含MgSO₄0.15～0.30M或含CaCl₂0.20～0.40M。

所述的特异性鲎试剂的制备方法，其步骤E中的G因子抑制剂是这样配制的：在适量纯化水中加入香菇多糖，使其在每毫升G因子抑制剂溶液中的含量为15mg～30mg。