[发明专利]一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及玻璃化超低温保存领域，具体涉及一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法。

背景技术

种质资源（Germplasm resources）是决定生物种性并将其丰富的遗传信息从亲代传给子代的遗传物质的总称，是物种进化、遗传学研究和植物育种的物质基础。实现种质资源保存是我国社会、生态及经济发展的战略需求。

超低温保存（Cryopreservation）是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。

玻璃化法（Vitrification）超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液（Plant Vitrification Solutions，PVS）中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。

国内外先后对200多种植物的不同外植体进行了超低温保存技术研究，但有些植物（如热带植物或者含水量高的植物）恢复培养后成活率不高或根本不能成活，添加一定的外源物质有利于提高超低温保存成活率，但如何从众多可添加的外源物质中筛选出效果较好的几种，一般离体组织筛选外源物质，组织或细胞超低温保存后活性检测手段不够直接，并存在一定误差，而直接观察恢复生长情况又较慢，并且很多进行超低温保存的材料为珍稀濒危保护植物，不能用大量材料消耗去筛选有效的外源物质建立超低温保存体系，以上原因大大制约了有效外源物质筛选及超低温保存体系建立的效率。而拟南芥幼苗的玻璃化法超低温保存研究发现了一套超低温保存标准体系，用于筛选外源物质及作为研究对象进行深入的超低温保存机理研究，可为植物超低温保存技术体系的建立及优化提供科学的理论依据，最终实现快速高效的优良植物种质资源中长期离体保存。

发明内容

本发明的目的在于针对现有超低温保存体系的上述不足，提供一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为有效外源物质的筛选提供了一条新途径，对植物种质资源保存起到了指导的作用。

本发明首先公开了一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。

较优的，所述筛选方法具体步骤如下：

1）拟南芥幼苗的获得：将拟南芥种子春化处理后，培养0～72h，获得不同苗龄的拟南芥幼苗；

2）将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组进行玻璃化超低温保存，实验组的玻璃化溶液中添加外源物质，对照组不添加；

3）将实验组和对照组玻璃化超低温保存后的幼苗解冻、恢复培养后，比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。

较优的，步骤1）所述拟南芥种子是经过消毒的拟南芥种子，所述消毒的方法为用65～75%乙醇消毒10～30s，无菌水冲洗2～4遍后再用含15～25wt%NaClO及0～0.03wt%Tween20的水溶液消毒5～15min，无菌水冲洗5～6遍。

更优的，步骤1）所述拟南芥种子是经过消毒的拟南芥种子，所述消毒的方法为用70%乙醇消毒15s，无菌水冲洗4遍后再用含20wt%NaClO及0.01wt%Tween 20的水溶液消毒10min，无菌水冲洗6遍。

较优的，步骤1）所述春化条件为0～10℃，春化处理时间为24～72h。

更优的，步骤1）所述春化条件为4℃，春化处理时间为48h。

较优的，步骤1）所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol m^-2，培养温度20～27℃；然后黑暗培养，培养温度为20～25℃。

更优的，步骤1）所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8h，光强150μmolm^-2，培养温度25℃；然后黑暗培养，培养温度为20℃。