[发明专利]一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法

权利要求书

1.一种促进玻璃化超低温保存的外源物质的筛选方法，其特征在于，为以拟南芥幼苗为实验对象，将外源物质添加到玻璃化溶液中用于拟南芥幼苗的玻璃化超低温保存，以不添加外源物质处理的拟南芥幼苗为对照，通过恢复生长率的比较评价外源物质的效果。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）拟南芥幼苗的获得：将拟南芥种子春化处理后，培养0～72h，获得不同苗龄的拟南芥幼苗；

2）将不同苗龄的拟南芥幼苗分为实验组和对照组进行玻璃化超低温保存，实验组的玻璃化溶液中添加外源物质，对照组不添加；

3）将实验组和对照组玻璃化超低温保存后的幼苗解冻、恢复培养后，比较实验组和对照组内苗龄相同的拟南芥幼苗的恢复生长率。

3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述春化条件为0～10℃，春化处理时间为24～72h。

4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1）所述培养是在MS固体培养基上，每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol m^-2，培养温度20～27℃；然后黑暗培养，培养温度为20～25℃。

5.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)获得的拟南芥幼苗的苗龄分别为0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。

6.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述玻璃化超低温保存方法为：将拟南芥幼苗放入装载液中，室温处理20～30min；将装载液吸除后，加入玻璃化溶液0℃处理40～60min；将置于玻璃化溶液中的拟南芥幼苗放入液氮中保存0.5～2h。

7.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤2）所述装载液为含有2M甘油，0.4M蔗糖的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v二甲基亚砜和0.4M蔗糖的MS培养液。

8.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤3）所述解冻方法为：将超低温保存的拟南芥幼苗从液氮中取出，35～40℃水浴解冻60～120s；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液室温处理30～50min，每隔5～10min换一次洗涤液；所述洗涤液为含有1.0～1.2M蔗糖的MS培养液。

9.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤3）所述恢复培养为将洗涤后的幼苗移到MS固体培养基中，每天先光照培养8～12h，光强100～200μmol m^-2，培养温度20～27℃；然后黑暗培养，培养温度为20～25℃。

10.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在拟南芥幼苗恢复培养的第15天统计成活的拟南芥幼苗的数量，计算恢复生长率，所述恢复生长率=成活的幼苗数量/幼苗总数量×100%。

11.权利要求1-10任一权利要求所述筛选方法筛选获得的抗坏血酸、脱落酸、甜菜碱、还原型谷胱甘肽之任一在玻璃化超低温保存中的应用。