[发明专利]一种尖孢镰刀菌的筛选方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及真菌的筛选方法及其应用，尤其涉及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的筛选方法及其应用。

背景技术

砷是一种在自然界广泛存在的有毒并且致癌的非金属元素，砷污染已成为全球危害十分严重的环境问题之一。据报道，全球至少5000多万人口正面临着地方性砷中毒的威胁，其中大多数为亚洲国家，中国是受砷中毒危害最为严重的国家之一，在1956-1984年二十多年间，中国曾发生过30余起地砷中毒事件。我国是砷矿大国，砷矿广泛分布在我国的中南和西南的湖南、云南、广西、广东等省区，砷矿开采或冶炼，含砷农药、化肥等农资产品的过量投入等，可造土壤砷的累积，进而影响着植物、动物的生长和发育，且可以通过食物链进入人体，对人类的生存和健康构成威胁。

目前常用的砷污染土壤修复方法包括土壤改良剂法、溶土法、排土法、化学冲洗法以及生物修复技术。

生物修复技术是利用生物(主要是微生物、植物)作用来消减、净化土壤中的砷或改变砷的形态，被普遍认为是砷污染治理中最具应用前景的技术。其中利用超积累植物去除土壤砷的植物修复技术在最近的几年中取得了突破性的进展，蜈蚣草(Brakefern，Pteris vitta)和大叶井口边草(Pteris nervosa)等超积累砷的植物相继被发现，并用于砷污染地区的土壤修复。在金属污染土壤的生物修复技术中，除了应用超积累植物吸收富集金属外，利用植物、微生物将金属转化为沸点较低的有机化合物挥发到大气中从而去除土壤中的金属也逐渐引起了人们的重视。如Terry等利用微生物和植物的作用，将环境中的硒(Se)转化为生物毒性较低的气态形式(二甲基硒和二甲基二硒)，直接或通过植物的组织挥发到大气中。Meagher等将细菌体内的汞(Hg)还原酶基因转入芥子科植物Arabidopsis后，得到的转基因植物能耐受、吸收土壤环境中的Hg，并将Hg²⁺还原成Hg⁰后挥发进入大气。土壤中的砷化合物也可以转变为气态的甲基砷等物质，在多个圈层中迁移和转化。因此，利用某些微生物的对砷的富集、利用和转化、挥发等功能，将As累积到生物体内或将其形成易挥发态砷化合物，已成为潜在的土壤As污染修复技术之一。

目前国内报道的对砷具有生物累积与挥发能力的真菌还没有，国外报道也屈指可数，且大多还只是局限于理论上的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种尖孢镰刀菌的筛选方法，将尖孢镰刀菌应用于治理砷污染土壤以及降低砷在作物及农产品中的累积。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种尖孢镰刀菌的筛选方法，包括：

采集砷污染土壤样品，在实验室内从所述土壤样品中分离出真菌，将所述真菌纯化后转接于尖孢镰刀菌的选择性培养基上；以该选择性培养基上生长状况最好的真菌菌株为对象，在固态PGP培养基上将该真菌菌株与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，观察该真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出尖孢镰刀菌。

该尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址标注在后)保存，保存编号为CGMCC No.3185，保存日期为2009年7月09日。

优选地，该方法具体包括：

将土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400～600mg/L的马丁培养基上分离出真菌；

将分离出的真菌经反复纯化后，分别挑取少量菌丝，接种于配好的尖孢镰刀菌的选择性培养基上，于24～26℃下培养5-7天后，以生长状况最好的真菌菌株作为接种目标，取直径为5～7mm的圆形菌块或边长为5～7mm的方形菌块放于PGP培养基上，在距菌块为1～3cm处分别放置浸有不同浓度砷溶液的直径为2～4mm的圆形滤纸片，砷浓度的范围设置为1000～30000mg/L；将PGP培养基于24～26℃下培养5天后，通过观察菌株的生长情况筛选出尖孢镰刀菌。

优选地，

马丁培养基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、琼脂以及水，各成分的重量比为5∶10∶2∶1∶80∶4000；