[发明专利]一种可溶藻的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生方法

权利要求书

1.一种溶解铜绿微囊藻的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）菌种活化培养：

将保藏的菌株F8重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，为10⁸-10⁹个/mL；

（2）原生质体的破壁酶解：

取4 mL活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用3.2-3.8mL的SMM缓冲液重悬；加入0.1-1 mg/mL的溶菌酶0.2-0.8mL，在水浴温度30℃条件下酶解0.17-1 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 mL 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮即可制备得到原生质体；

（3）原生质体的再生：       

取上述步骤的原生质体悬浮液，用高渗NaCl溶液稀释到合适的三个梯度，分别吸取200 μl涂布于高渗固体培养基，每个梯度做三个平行，置于30℃恒温培养箱培养48 h，使得原生质体再生。

2.根据权利要求1所述的一种溶解铜绿微囊藻的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于所述的溶藻细菌（Lysinibacillus fusiformis），保藏号为CGMCC NO.6106。

3.根据权利要求1所述的一种溶解铜绿微囊藻的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于步骤（1）中菌种活化培养用细菌培养基组成如下：牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0-7.2；若为固体培养基则添加琼脂粉2.4%；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

4.根据权利要求1所述的一种溶解铜绿微囊藻的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于步骤（3）中原生质体的再生用的高渗液体培养基组成如下：蛋白胨 10 g，酵母浸出汁 5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 170 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.2；若为高渗固体培养基则加入琼脂粉20-24 g；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。

5.根据权利要求1所述的一种溶解铜绿微囊藻的赖氨酸芽孢杆菌的原生质体制备与再生方法，其特征在于所述的溶液配制如下：（1）高渗NaCl溶液：NaCl 0.55 mol/L；（2）SMM缓冲液：蔗糖 0.55 mol/L，顺丁希二酸 20 mmol/L，MgCl₂·6H₂O 20 mmol/L，pH 6.8；（3）溶菌酶：0. 1-1 mg/mL，SMM缓冲液配制；上述溶液根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min。