[发明专利]充分分离植物组织的方法和装置

说明书

本申请是申请日为2008年8月29日、申请号为200880108777.2、发明名称为“充分分离植物组织的方法和装置”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

本申请要求2007年8月31日提交的美国临时申请60/969,287的优先权，本文完整引入其公开作为参考。

技术领域

本发明一般地涉及充分分离适于遗传转化或组织培养的目标植物组织，如胚。

背景技术

制备用于植物繁殖、再生和转化的组织耗时费工，尤其是因为它通常包括手工切除可转化或可培养的植物组织。例如，在玉米(Zea mays)中，通常手工切除单个的未成熟胚以提供可遗传转化的外植体。胚性组织(embryogenic tissue)的手工切除费力，且具有对工人造成人体工程学损伤的风险。此外，当高通量的转化和植物生产需要较大量的可转化的植物组织时，必须雇用和培训更多的工人以满足增加的需求。此外，获得的植物组织的质量可以存在明显的差异，这取决于工人个人的技术水平、小心、注意力和疲劳程度。

在分离可转化的植物组织的先前技术中，组织差异和缺乏自动化的可行性造成了问题，因为质量差的组织负面影响随后的组织培养、遗传转化和植物繁殖。然而，甚至为生产适于商业开发和农业使用的单个转基因植物，也可能有必要完成单一品种的数以万计的单个转化事件。因此，在本领域中非常需要改良的制备目标植物组织的方法，其更有效，减少工人的整体劳动负担，减少处理植物材料所需的劳动量，和/或其产生比手工生产的组织具有更高、更一致的质量的植物组织。

发明内容

在一个方面，本发明提供了获得适于组织培养和/或遗传转化的胚的方法，包括在基本上由水和/或具有大约0mOsm/kg至大约600mOsm/kg的摩尔渗透压浓度(osmolality)的渗透剂组成的液体培养基中从植物种子至少部分地切除胚，其中，在从植物种子切除胚后，胚仍然保持进行组织培养和/或遗传转化的活性。渗透剂可进一步是惰性渗透剂。在进一步的实施方式中，该方法包括在液体培养基中从植物种子或穗的群体至少部分地切除多个胚。渗透剂可以选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖或其它渗透剂。在特别的实施方式中，培养基基本上由水和/或浓度为大约0.05M至大约0.5M的甘露醇或浓度为大约0.05M至大约0.5M的蔗糖组成。该方法可进一步包括遗传转化所述胚和从转化的胚再生转基因植物的步骤。

在该方法的某些实施方式中，胚遗传转化的步骤包括使用包括杀菌剂的共培养培养基。在特别的实施方式中，杀菌剂是羧苄青霉素。在更另外的实施方式中，共培养培养基包含大约0.5-1.5mg/L的2，4-D。

胚可以是禾本科(Poaceae)成员，如玉米、水稻、小麦或小米。在特别的实施方式中，胚是玉米胚或小米胚。在其它的实施方式中，胚可以是大豆胚、棉花胚或另一种双子叶植物的胚。

在另一种实施方式中，该方法包括在包括以下部分的培养基制备系统中制备液体培养基：(a)水的入口；(b)渗透剂的入口；和(c)用于混合水和渗透剂以产生液体培养基的室，其中，水的入口和渗透剂的入口连接到混合室上以使水和渗透剂输送到混合室。在某些实施方式中，水的入口和/或渗透剂的入口连接到容纳水和/或渗透剂的一个或多个室。该方法可以进一步包括连接混合室和流体喷射装置。在其它的实施方式中，该方法进一步包括用选自过滤器、紫外辐射源或γ辐射源和灭菌热源的灭菌装置对液体培养基灭菌。灭菌装置可以在水和/或渗透剂进入混合室之前对其灭菌。或者，灭菌装置在液体培养基进入混合室的同时和/或之后对其进行灭菌。在再另一种实施方式中，该方法包括在液体培养基离开混合室后对其进行灭菌。

该方法可以进一步包括测量容纳水的室、容纳渗透剂的室或混合水和渗透剂的室中的一个或多个的填充水平。在进一步的实施方式中，该方法包括控制水和渗透剂向用于混合水和渗透剂的室的输送。在特别的实施方式中，该方法包括通过电子感应水和/或渗透剂的输送来控制输送。

在另一个方面，用于制备适于组织培养和/或遗传转化的植物胚的方法包括：(a)将包括植物胚和/或种皮的植物种子组织置于水性环境中；(b)将所述组织与选择性地附着到胚或种皮上的试剂接触；和(c)根据试剂对胚或种皮的选择性附着分离至少第一胚。在某些实施方式中，所述试剂包括气泡。在特别的实施方式中，气泡具有大约100微米至大约1mm的最大平均尺寸。在某些实施方式中，气泡可能包含选自空气、氧气、氮气及其组合的气体。此外，在某些实施方式中，步骤(c)包括根据胚的浮力分离第一胚。