[发明专利]一种血清microRNAs试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种血清microRNAs试剂盒及其应用。 

背景技术

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，居于女性肿瘤发病率的第二位，全球每年约有50万宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例比重高达5%，我国每年新发宫颈癌病例约为13.2万，属于高发区。宫颈癌的死亡率也很高，全球每年约有23万女性死于宫颈癌，我国每年约有3万女性死于宫颈癌。采取有效的诊断方法，早期诊断早期治疗，能够有效降低癌症的发生率，提高治愈率。 

MicroRNAs(miRNA)是一类长度约为22nt的非编码单链小分子RNA，miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，并且大部分定位于基因间隔区，在进化上高度保守，MiRNA的转录独立于其他基因，不具有开放阅读框（ORF）所以不翻译成蛋白质，而是在体内多种生理过程中起到调控作用，包括细胞增殖、分化、凋亡等。本实验室前期通过系统的研究发现miRNAs稳定地存在于哺乳动物的血清中。血清中稳定存在多种miRNA的发现也引起了人们对其来源和产生方式的研究和探索。目前认为血清中的miRNA与相关组织的分泌密切相关。 

MiRNAs具有内在的调控基因表达的功能，提示那些在肿瘤中特异性表达的miRNAs可能在肿瘤的发生和发展的过程中发挥特殊的作用，近期，在对肿瘤患者血清miRNAs变化机制的研究中发现，在肿瘤中高表达的miRNA可能发挥与癌基因相似的作用，而在肿瘤中低表达的miRNA可能与抑癌基因有相似的作用，这对于肿瘤的临床诊断、治疗方案的选择和预后具有指导意义。 

与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性、可连续体外检测等优点。构建肿瘤特异性血清microRNA表达谱，有望成为一种基于血清检测癌症的分子标记。 

发明内容

本发明的需要解决的问题是通过检测宫颈癌血清中miRNA的表达水平,筛选并鉴定能够作为宫颈癌检测标志物的血清miRNAs, 进行血清miRNA检测试剂盒的研制。 

1．本发明首先在基因组范围内通过solexa测序筛选出在正常人和患者血清中表达存在明显差异的一组miRNAs；然后利用RT-qPCR法进行了两个阶段独立样本的复筛和验证；最后利用ROC曲线法分析其灵敏度和特异性。 

2．血清采集均严格按照如下步骤进行：收集患者和正常人全血，在室温下3000g离心10min去除血细胞并收集血清，然后将收集的血清在4℃条件下，12000g离心15min，进一步去除残留的血细胞，离心后收集血清置于-80℃冰箱保存待用。 

3．一组由5种血清miRNAs组成的宫颈癌血清诊断标志物，分别是miR-21, miR-29a, miR-200a, miR-25和miR-486-5p。ROC曲线分析结果显示，对比传统血清SCC和CA125检测，血清miRNAs标志物具有高灵敏度和特异性。 

    本发明与现有技术相比其有益效果是：筛选出的疾病特异血清miRNA，进行血清miRNA检测试剂盒的研制，该芯片可以识别宫颈癌病人的发病及分级情况，实现宫颈癌早期诊断的目的。本发明的主要创新点包括：血清miRNA是一种新型生物标志物；血清miRNA监测是一种系统、全面的检测试剂盒，与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性，本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系。 

四、附图说明

   图1  为5种血清miRNAs在宫颈癌患者和正常人中表达存在明显差异；

图2  由5种血清miRNAs组成的宫颈癌标志物的ROC曲线分析结果

图3 为本发明实验设计流程

五、具体实施方式

1、进行Solexa测序实验时，我们分别混合了20例宫颈癌患者（每人2ml）和20位健康对照（每人2ml）的血清。每组混合血清的总RNA是严格按照Trizol LS Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)的人工操作指南提取的。

1)   将收集的血清样本包括AMI组和正常对照组的血清分别进行混合，得到两组混合血清，体积均为40 ml，分别提取混合血清RNA。 

2)   按混合血清体积（均为40 ml）2:1的比例加入TRIzol，用力震荡均匀后，室温静置15min，然后加入TRIzol 1/5体积的氯仿，用力震荡均匀，室温静置15min。