[发明专利]一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与基因工程制药领域，具体涉及一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

红细胞以及由其所产生的血红蛋白在机体生命活动中发挥着重要作用。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是体内红细胞生成过程中最重要的调控因子，在正常成年人中EPO主要由肾脏产生。慢性肾衰时，肾脏产生EPO相对不足或不能分泌EPO，从而导致贫血。因此，应用重组人促红细胞生成素（rh-EPO）可以有效治疗肾性贫血。此外，rh-EPO还可用于实体瘤放/化疗所致贫血、外科手术红细胞动员、自体输血等的辅助治疗。

现有的重组EPO类药物，其生产都需要采用哺乳动物细胞系统进行表达和制备，原因是EPO分子必需经过翻译后的糖基化修饰才具有生物活性。与大肠杆菌和酵母表达系统相比，采用哺乳动物细胞表达系统生产目的蛋白的周期相对较长，成本也相对较高。

EPO模拟肽（Erythropoietin mimetic peptide, EMP）是1996年Wrighton等采用噬菌体展示技术从肽库中筛选出来的一种含有20个氨基酸的多肽，其氨基酸序列与EPO完全不同源，但却能特异性结合EPO受体，尤其是该多肽的二联体能够有效激活EPO受体及相应的细胞内信号通路，从而产生与EPO相似的生物学功能（Wrighton, et al., Science, 1996, 273: 458-463）。由于不需要糖基化修饰，所以无论是化学合成，还是通过细菌或酵母表达系统所制备出的EMP二联体都具有较高的生物活性。然而，EMP的分子量较小，难以通过基因工程技术进行表达与制备，而且由于半衰期短，其体内应用效果也较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白可显著延长EMP二联体半衰期，具有长效促红细胞生成的特性。

本发明所述的促红细胞生成素模拟肽与人血清白蛋白HSA的融合蛋白，包含1个人血清白蛋白HSA和1个由两个头尾串联的促红细胞生成素模拟肽EMP组成的EMP二联体（dEMP）。

人血清白蛋白HSA存在天然多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白HSA也包括这些多态型。

优选地，所述促红细胞生成素模拟肽EMP具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述促红细胞生成素模拟肽EMP活性的氨基酸序列。

优选地，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或在该氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述人血清白蛋白HSA活性的氨基酸序列。

优选地，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的N-末端， EMP二联体位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为HSA-dEMP，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。

优选地，所述EMP二联体位于融合蛋白的N-末端，所述人血清白蛋白HSA位于融合蛋白的C-末端，在人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间均设有连接肽，所述融合蛋白用结构式表示为 dEMP- HSA，具体地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间以及两个EMP之间的连接肽均由1-30个氨基酸残基组成。

更优选地，所述人血清白蛋白HSA与EMP二联体之间的连接肽由13个氨基酸残基组成，两个EMP之间的连接肽由4个氨基酸残基组成。

更优选地，组成连接肽的氨基酸主要为Gly与Ser 、Pro的组合。

本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，主要包含步骤：

1）获取编码EMP二联体和连接肽的基因序列，通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将该基因序列克隆至载体质粒1中，获得质粒2；

2）以含有HSA的质粒DNA为模版， 通过PCR扩增获得两端带有合适限制性内切酶识别位点的HSA 的cDNA 片段；

3）通过限制性内切酶酶切、连接并转化大肠杆菌，将编码HSA的cDNA 片段插入含有EMP二联体的基因的质粒2中，获得含编码HSA与EMP二联体的融合蛋白的基因的质粒3；