[发明专利]一种高通量检测食源性致病菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品检测、公共卫生和细菌学领域。具体而言，本发明涉及一种高通量、快速检测致病菌(优选食源性致病菌)的新方法。 

背景技术

食源性疾病，包括食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、肠源性病毒感染等，是当今最广泛的公共卫生问题之一，而引起这些食源性疾病的主要因子是致病细菌。要从根本上解决食品安全问题，就必须对食品的生产、加工、流通和销售等各环节实施全程管理和监控，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的食品安全分析检测技术。 

目前，食品检验检疫工作中的细菌鉴定主要方法有：传统的细菌分离培养和鉴定方法、PCR、Southern Blot杂交(即DNA印迹法)、ELISA等分子生物学和免疫学方法。 

但是，传统检测方法操作繁琐、耗时费力，一般需要5天，有的甚至需要一个月的时间；ELISA方法虽然灵敏度高，但容易污染，出现假阳性；采用多重PCR技术，虽然可以达到对单一菌的快速、准确和方便的诊断目的，但在病原菌未明时，需要采用多种不同引物进行试验，这对病原菌的复杂性和PCR程序的多样性来说是不够理想的。 

随着生物芯片技术的日趋成熟，高效、快速、准确、灵敏的生物芯片技术被应用到越来越多的领域，其中就包括食品微生物检测领域。液相芯片技术是新近开发出的新一代分子诊断技术平台，该平台既能保证信息质量，又能提供相对高通量的检测，其高通量、高精确性的特点提供了食源性细菌所需的多指标联合检测的思路。 

目前最先进的技术是科学家韩健博士发明的Tem-PCR(target enriched multiplex PCR，靶序列富集多重PCR)技术与液相芯片检测技术的结合运用，该技术能在一次反应中对多种靶序列进行高度敏感和特异的扩增和检测，其主要 原理是，针对待扩增的每一种靶序列，设计两对巢式的特异性引物：F0，R0；Fi，Ri。其中的Fi和Ri引物带有一个能被通用的超级引物(Super Primer)识别的标签序列。巢式的靶序列特异性引物的浓度极低，用于在PCR的最初几个循环中富集目标序列。只有超级引物的浓度足以进行指数扩增，而且只有反向超级引物进行了生物素的标记。最后通过液相芯片检测平台输出信号，达到检测目的。该技术与普通PCR技术相比具有兼容性好、特异性强、效率超高、可半定量等优点，但是该技术也存在对所需DNA模板要求高、PCR反应时间长、敏感性不够强等缺点。 

细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构包含保守区及可变区。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因，其长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。 

在核糖体RNA(rRNA)特征序列中，经研究认为16S rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适，其主要依据是：它们为细胞所共有；其功能同源且最为古老；既含有保守序列又含可变序列；分子大小适合操作；它的序列变化与进化距离相适应。依据16S rRNA序列绘制的生命进化树，卡尔·沃斯(Carl Woese)将地球上的所有细胞生物划分为3个域(domain)，即古生菌(Archaea，也称Archaebacteria)、细菌(Bacteria，也称Eubacteria)和真核生物(Eukarya)。16S rRNA序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同，随着微生物核糖体数据库的日益完善，该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。 

关于16S rDNA的数据库信息及分析软件较其它分类鉴定用的基因丰富得多，如RDP(http：//rdp.cme.msu.edu/html/)、ARB(http://www.ard-home.de/)、ORS(http://soul.mikro.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)、OPD(http://www.com.msu.eduOPD/)及PRIMROSE、CLUSTAL-X、PRIMER PREMIER、DNA START等，各分析软件因采用的算法不同而各有所长。 

然而，本领域中尚未提供同时检测样品中多种致病菌的方法。本领域中仍然迫切需要开发出能够克服目前致病菌检测中的不足、高通量、快速检测多种致病菌的方法。 

发明内容