[发明专利]一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用

说明书

技术领域

    本发明提供了一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用，属于基因工程生物技术领域。

背景技术

原发性肝细胞性肝癌（简称肝癌，HCC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，2007年12月美国癌症学会（ACS）发布的数据显示：肝癌年增66.7万例，死亡59.8万例，其中约50%的新患病例和死亡病例在中国，即肝癌对我国人民的健康威胁更大，已成为我国第二位肿瘤杀手，不仅使患者痛苦不堪，生存率低，而且给家庭、社会带来严重的经济和心理负担。

单核苷酸多态性 (SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP作为稳定遗传的早期突变，与疾病密切相关。当一种SNP在患者中的出现频率明显高于非患者，提示该SNP与此疾病相关，通过分析研究两者的单倍型和连锁不平衡性，可将基因组中任何未知的致病基因定位。SNP在致病基因定位中发挥的作用主要包括：一是在寻找致病SNP，这种SNP的出现可导致基因在表达量和（或）蛋白表达产物结构的变化，从而导致某种疾病的发生或使得个体对某种疾病易感；二是SNP作为一种遗传标记，与疾病或者表型连锁。

Klotho是1997年发现与衰老相关的基因，位于人类染色体13q12，长度约为50kb，由5个外显子和4个内含子组成。Klotho基因在小鼠中的表达缺失导致其出现类似于人类衰老的各种表型，如动脉硬化、骨质疏松、肺气肿、寿命缩短、皮肤萎缩、不育症、运动失调等。近年来，越来越多的研究发现klotho基因可以调节IGF、Wnt、TGF-β1、FGF等信号通路，参与氧化应激过程，并且与机体的免疫缺陷有关，在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥类似抑癌基因的重要作用。因此可以利用klotho来作为肿瘤发生、分级的标志物以及作为靶点用于抗肿瘤的治疗。

对现有技术的国内外文献和专利进行检索，至今未见任何klotho基因多态性与肝细胞肝癌易感性关系的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于填补现有技术的空白，提供一种原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性其构建方法及其应用。

本发明提供了一种检测原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性的方法，采用PCR-RFLP方法，包括以下步骤：

⑴以包含klotho基因的待测人全基因组DNA为模板，PCR扩增得到klotho基因外显子4区的包含rs648202单核苷酸多态的DNA序列，即SEQ ID No.1中第2190位至第2352位所示序列，  

其中，PCR引物序列如下：

上游引物为F: 5'- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3'   

下游引物为R: 5'- TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3'

⑵ 对PCR扩增产物经限制性内切酶Hae III进行酶切后通过琼脂糖凝胶电泳进行rs648202单核苷酸多态分型，CC基因型酶切后的DNA片段长度仍为163bp；CT基因型酶切后产生163 bp、100 bp、63 bp三种长度的DNA片段；TT基因型酶切后产生100 bp、63 bp二种长度的DNA片段。

本发明还提供了一种分离核酸，具有SEQ ID No.1中第2190位至第2352位所示序列，且在SEQ ID No.1中的第2255位的碱基为T。

本发明还提供了一种检测原发性肝细胞性肝癌相关的klotho基因单核苷酸多态性的特异性引物，上游引物为F: 5'- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3' ，下游引物为R: 5'- TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3'。

本发明还提供了一种原发性肝细胞肝癌易感性的诊断试剂盒，它包括：

（1）特异性扩增klotho基因单核苷酸多态性rs648202的引物，其中，上游引物为F: 5'- ATAGCCTTGCAGGCTGATTG -3' ，下游引物为R: 5'- TTCTTTGGTTCAGCCAGTCC -3'；

（2）检测扩增产物与正常的klotho基因相比是否存在变化所需的试剂。

    利用本发明所提供的与原发性肝细胞肝癌相关的多态性位点的核酸序列，可构建对原发性肝细胞肝癌易感人群进行遗传筛选的试剂盒，将其作为药物设计的靶点，找出具有调节klotho基因表达的活性分子，从而促进新的抗肿瘤药物的发现。

本发明具有如下技术效果：