[发明专利]一种快速鉴定瓜类疫霉对CAA类杀菌剂抗药性的方法及专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及瓜类疫霉纤维素合酶相关基因CesA3的克隆及其在CAAs杀菌剂抗性监测中的应用，具体公开一种快速鉴定瓜类疫霉CesA3基因的核苷酸点突变及其对CAA类杀菌剂抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

由瓜类疫霉侵染黄瓜导致的黄瓜疫病在我国黄瓜产区的一种常见病害，在北京、上海、南京、杭州和武汉郊区的黄瓜种植区尤为常见。该病害可以对黄瓜产量造成严重损失，甚至可以减产80％。瓜类疫霉还可以侵染葫芦科作物，包括黄瓜、西葫芦、哈密瓜、冬瓜、葫芦等作物，引起产量损失。

目前化学防治仍是植物病害防治过程中使用的重要手段。用于防治瓜类疫霉等植物病原卵菌引起的病害的杀菌剂主要有以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，然而病原卵菌对该类杀菌剂广泛产生抗药性，因此在生产实践中主要以复配方式使用苯酰胺类杀菌剂。羧酸酰胺类杀菌剂(Carboxylic acid amide，CAAs)是一类新型用于卵菌病害防治的杀菌剂，其中主要代表有烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺以及异丙菌胺等。然而在使用该类杀菌剂若干年之后，已经在田间采集的葡萄霜霉病菌中检测到对CAA类杀菌剂产生抗性的群体。

植物病原菌抗药性检测方法有以下几种：菌落生长测定法、菌丝干重测定法，这两种方法能准确反映杀菌剂对菌体生长的抑制作用；孢子萌发测定法适用于测定容易产生孢子的病原菌，如小麦锈病和黄瓜霜霉病菌；还有琼脂展布法、抑菌圈测定法等。但是这些方法都需要通过测定药剂对病原菌的EC₅₀来比较敏感和抗性菌株的差异，试验需要多个处理，多次重复，因此检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多。而且上述常规方法检测灵敏度低，抗药性菌株的突变频率在1％以上才能被检测到。由于病原菌的繁殖、传播速度一般都很快，在自然界存在的数量又很大，因此经过几次药剂选择后，抗药性病原菌亚群体可能会成为致病病原群体的主体，造成病害大流行。

随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间、提高了工作效率，而且提高了检测的灵敏度，检测频率在10^-5～10^-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早起诊断的理想方法。可以预测，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对。

本发明提供的检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测瓜类疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为497bp的片段，则所述待测瓜类疫霉中CesA3基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指瓜类疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3455位核苷酸为C。

所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3455位核苷酸也就是SEQ ID NO：7中自5’末端起第3455位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为68.5℃。

本发明所提供的检测或辅助检测瓜类疫霉中CesA3基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供瓜类疫霉中CesA3基因或蛋白的突变位点。

本发明所提供的瓜类疫霉中CesA3基因的一个突变位点，为瓜类疫霉中CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3455位核苷酸为C。所述CesA3基因的基因组序列自5’末端起第3455位核苷酸也就是SEQ ID NO：7中自5’末端起第3455位核苷酸。

本发明所提供的瓜类疫霉中CesA3蛋白的一个突变位点，为瓜类疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸为亮氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1109位氨基酸也就是SEQ ID NO：6中自N端起第1109位氨基酸。

上述任一所述突变位点在鉴定瓜类疫霉抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为抗CAA类杀菌剂。