[发明专利]一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用类转录激活子核酸酶快速基因编辑的方法，具体涉及一种在小鼠细胞中基因定点突变的构建方法。 

背景技术

随着人类基因组计划的完成，后基因组时代的生物研究迫切需要有效的手段来进行基因功能的分析。由于生理和遗传层面同人类较高的一致性，基因敲除小鼠模型成为了破译人类基因功能及寻找人类疾病治疗手段的有力工具。 

基因打靶技术是构建基因敲除小鼠的主要传统手段。基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。 

传统基因打靶技术的限制因素之一是周期长且难度大的打靶载体构建过程。其次，由于动物细胞内自发的同源重组发生率只有10^-5-10^-6，将打靶载体电转入小鼠胚胎干细胞之后，要花费大量时间和人力物力筛选发生目的同源重组的胚胎干细胞。而且ES细胞在体外培养过程中对培养条件要求苛刻，稍有不慎将会引起其不可逆的分化，而使其失去生殖系转移能力，不能在后续操作中产生突变子代。再次，显微注射的ES细胞仅有一定的概率成功整合成为能够形成配子的生殖系细胞。并且要求ES细胞处于良好的生长及未分化的状态。另外，如果已有现成的目的基因被靶向的ES细胞，但与欲研究的小鼠品系不同，则将需要花费大量的时间进行回交，以稀释ES细胞原有的遗传背景。 

人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术是近年来发展起来的一项基因组定点修饰的技术。ZFN是一种由靶向特定DNA序列的锌指蛋白和具有非特异性作用的FokI核酸内切酶切割结构域组成的重组蛋白。一对人工设计的，识别特定的DNA序列的ZFN与目标DNA序列(通常为相邻两段各18-24bp，间隔4-7bp)结合之后，它们的FokI核酸内切酶将形成二聚体，从而切割DNA双链，形成双链断裂(double strand break，DSB)。该损伤主要通过易错性的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)以及高保真性的同源重组(homologous recombination，HR)进行修复。其中非同源末端连接通过造成目的基因的移码，可被用来对目的基因进行基因敲除。通过在受精卵阶段显微注射编码ZFN的DNA或相应mRNA，已实现对小鼠，大鼠，斑马鱼等模式生物的基因敲除。 

尽管ZFN技术在基础研究和应用领域有着广阔的前景，然而根据需要构建对特定DNA序 列有高度特异性和亲和力的ZFN是一项劳动量大，周期长，成功率低的工作，这已经成为阻碍该ZFN大规模应用的瓶颈。ZFN的DNA识别结构域由若干个锌指模块组成，每个锌指模块识别特定的3个连续碱基，因此相邻的3～6个锌指模块可识别DNA上连续的9～18bp个碱基。这种三连体识别模式意味着在可供靶向的DNA序列选择上有更小的灵活性。尽管已有数百种锌指模块，但是并没有涵盖所有可能的碱基排列组合。同时由于相邻锌指模块间的相互作用会影响其碱基识别的特异性(context dependence)，因此ZF在构建过程中要经过大量的优化才能实现对目的基因的特异性结合。另外由于ZF相对较低的DNA结合特异性，ZFN在细胞内的过表达会由于脱靶效应(Off Target Effect)造成较高的细胞毒性。 

发明内容

本发明的目的克服现有技术在构建基因敲除小鼠技术中存在的周期长，工作量大，难度高，效率低等不足，提供了通过在小鼠受精卵显微注射体外转录的靶向目标基因的TALEN信使RNA，实现快速构建基因敲除小鼠的方法。本发明涉及一种利用类转录激活子核酸酶快速构建靶向性基因组DNA改变的基因修饰小鼠的方法及其应用。 

本发明提供了一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法，通过在小鼠胚胎细胞中引入特定核算序列构建基因定点突变小鼠，包括以下步骤： 

(1)在小鼠目标基因组序列中确定目标靶序列； 

(2)按所述目标靶序列的顺序，构建能够识别并切割目标基因的TALEN核酸序列； 

(3)将所述TALEN核酸序列导入小鼠胚胎细胞内； 

所获得的小鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，表达TALEN并切割目标基因组，从而筛选目标基因突变的小鼠。与传统方法相比，本发明方法省略了体外进行ES细胞筛选的过程，整个操作过程只需直接将核酸导入胚胎中，不需要将ES细胞引入胚胎，避免了因ES细胞在体外培养时因培养条件不符合要求时导致的不可逆分化。