[发明专利]一种能够表达人抗体的转基因动物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种产生人抗体的小鼠的制备方法。 

背景技术

由细菌、真菌、病毒和寄生虫导致的感染性疾病的治疗很大程度基于抗生素的治疗。然而，抗药性的出现要求不断开发新的抗生素。患有恶性疾病和癌症的患者的治疗主要基于化疗，然而，这些治疗中的许多是无效的，并且患者的死亡率高，对于感染性疾病和癌症，需要改进和创新的治疗。抗移植器官排斥的甾体类治疗需要使用生物试剂(单克隆或多克隆抗体制剂)，该生物试剂在移植受体中逆转正在进行的同种异体免疫应答。从动物获得的抗体制剂的主要问题是人类患者中非人免疫球蛋白的免疫原性。为了减少非人免疫球蛋白的免疫原性，提出了在动物中对抗体基因进行改构.例如，已经证明通过融合鼠源抗体可变(V)区外显子和人恒定(C)区外显子，可以获得嵌合抗体基因。然而，该方法只能去除由非人Fc区导致的免疫原性，而其余的非人Fab序列仍然可以是免疫原性的。在另一种方法中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因导入了小鼠基因组中。已经有几种将人免疫球蛋白基因导入小鼠基因组中使人各种抗体所有组成组件在基因工程化小鼠中的表达的方法。我们提供了一种利用细菌人工染色体载体(BAC)将人免疫球蛋白重链和轻链基因导入了小鼠基因组中的方法。在小鼠血清中可以检测到人抗体的分泌。 

发明内容

本发明提供包含两个人免疫球蛋白基因座部分片段的转基因非人类哺乳动物，其中所述两个人免疫球蛋白基因座中的一个是人重链基因座，而另一个基因座是人轻链基因座的。在某些转基因非人类哺乳动物中，所述人免疫球蛋白基因座包含人类14号和2号染色体的片段，所述人免疫球蛋白重链与轻链基因座随机整合在非人哺乳动物基因组DNA中。在这些转基因非人类哺乳动物中，所述人重链和轻链基因座的被克隆到细菌人工染色体(BAC)载体中，所克隆的人免疫球蛋白重链基因座部分片段包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、D区基因(D)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及重链基因座的3‘-增强子核心序列，所述 序列可以在不同的BAC载体中。所克隆的人免疫球蛋白轻链基因座部分片段包含至少一个非重组过的可变区基因(V)、连接区基因(J)和恒定区基因(C)以及轻链基因座的3‘-增强子核心序列，所述序列可以在不同的BAC载体中。在某些转基因非人类哺乳动物中，所述转基因非人类哺乳动物是小鼠。在转基因非人类哺乳动物中，所述内源哺乳动物重链基因座和至少一个哺乳动物轻链基因座被失活。在某些这样的转基因非人类哺乳动物中，所述内源哺乳动物重链基因座(IgH)和K轻链基因座(IgK)和Lamda轻链基因座(IgL)被失活。 

本发明还提供检测转基因非人哺乳动物血清中人抗体表达的方法，所述方法包括：小鼠血清的制备，酶联免疫竞争的方法检测小鼠血清中人抗体IgM的浓度。 

本发明还提供用于产生多种表达人抗体序列的B细胞的方法，所述方法包括：提供包含两个人免疫球蛋白基因座部分序列的转基因非人类哺乳动物，其中所述两个人免疫球蛋白基因座中的一个是人重链基因座，而另一个基因座是人轻链基因座；并且其中所述基因座中至少一个是由BAC载体导入的；并且对所述转基因非人类哺乳动物免疫，可以产生多种表达人抗体序列的B细胞并收集多种表达人抗体表达序列的B细胞。这些方法还包括使所述多种B细胞与骨髓瘤细胞融合形成可以分泌人单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法。其它这样的方法还包括从所述杂交瘤细胞中克隆和纯化所述人抗体序列，所述编码人抗体的序列是全长的。在某些方法中，所述编码人抗体的序列在转染细胞中表达。在某些这样的方法中，所述人轻链基因座包含得自天然人K轻链基因座的未经重排的序列。在某些这样的方法中，所述人K轻链基因座是插入的BAC载体介导的人轻链基因座片段转基因。在某些这样的方法中，所述多种B细胞至少包含编码具有选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中某种抗体类型的B细胞。在某些方法中，所述IgA同种型是IgA1或IgA2。在某些方法中，所述IgG同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些这样的方法中，所述多种B细胞至少包含编码具有选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的不同于所述第一同种型的第二同种型的抗体的第二B细胞。在某些方法中，所述多种B细胞至少包含5种B细胞，每种B细胞编码一种具有不同同种型的抗体，其中所述抗体的类型分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。