[发明专利]一种猪嵴病毒RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪的一种病毒抗原检测试剂盒，具体说是一种猪嵴病毒核酸RT-PCR快速诊断试剂盒。 

背景技术

猪嵴病毒(Porcine Kobuvirus)是一种无囊膜正链RNA病毒，属小RNA病毒科、嵴病毒属，嵴病毒属包括人爱知病毒(Aichi virus)、牛嵴病毒(Bovine kobuvirus)和猪嵴病毒(Porcine kobuvirus)等。自2008年猪嵴病毒在匈牙利被报道后，在中国、泰国、朝鲜、韩国、巴西和荷兰等国家都被检出。根据有关资料显示猪嵴病毒在我国猪群中的感染率也较高，且在临床表现为腹泻症状的猪中阳性率要明显高于无腹泻症状的猪^[2]。目前普遍认为该病毒可能与仔猪腹泻相关，但在其病毒结构和功能、发病机理、致病性等方面还存在许多问题尚未得到解决。 

猪嵴病毒广泛分布于猪群中，3周龄以内的小猪感染率最高，且在粪便中的检出率远远高于血清。虽然猪嵴病毒的致病性尚未确定，但有报道指出，在对腹泻猪粪便样品进行的病原分子检测中，主要引起猪腹泻的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻均为阴性，少数轮状病毒呈阳性，而猪嵴病毒的阳性率最高，初步推测该病毒可能与仔猪腹泻相关。因此，研发一种针对猪嵴病毒的快速准确RT-PCR检测试剂盒，对于我国猪群中嵴病毒分子流行病学调查和其他相关研究意义重大。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪嵴病毒核酸RT-PCR检测试剂盒。根据猪嵴病毒保守的3D RNA聚合酶区域，设计特异性病毒核酸引物，用RT-PCR的方法，对猪群中猪嵴 病毒的感染情况进行监测。该试剂盒所用时间相对较少，灵敏度高，适用于猪嵴病毒病原的快速诊断，可为猪嵴病毒的分子流行病学调查及相关研究提供相关技术支持。 

为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案： 

试剂盒的组成及使用方法： 

1.试剂盒的组成 

按照每个试剂盒检测20个样品计，每次检测样品时设阳性、阴性对照，试剂盒组成： 

阳性对照模板：猪嵴病毒阳性样品抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次1ul； 

阴性对照样品：SPF猪粪便样品和PBS按SPF猪粪便样品的重量：PBS的体积＝0.5～1.0：1加入PBS混匀，3000r/min离心15min，取上清液抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次用1ul； 

上游引物P1和下游引物P2浓度均为10pmol/ul，各30ul，每个样品各用0.5ul； 

上游引物P1：5’-CGTCTCATTGGAGATGAACG-3’； 

下游引物P2：5’-TTTGTCGTAGAACTCCTTGA-3’； 

2×Taq PCR Master Mix：300ul，每个样品用5ul； 

ddH₂O：200ul，每个样品用3ul； 

矿物油：600ul，每个样品加10ul。 

2.使用方法： 

反应体系：2×Taq PCR Master Mix 5ul、ddH₂O3ul、上游引物P1、下游引物P2各0.5ul、反转录模板1ul、矿物油10ul； 

PCR反应条件：95℃5min；95℃30s、50℃30s、72℃30s(反应30个循环)；最后72℃延伸10min。 

本发明与现有技术相比有以下优点：灵敏度高，最低可以检测1pg病毒核酸；检测时间短。 

附图说明

图1：PCR扩增电泳图，M：marker DL2000；1：猪嵴病毒；2：阴性对照； 

图2：特异性实验，M：marker DL2000；1：猪嵴病毒2：猪蓝耳病毒3：猪伪狂犬病毒4：猪瘟病毒5：猪传染性胃肠炎病毒6：猪流行性腹泻病毒7：猪轮状病毒。 

图3：敏感性实验，M：marker DL2000；1：H₂O；2：1pg；3：10pg；4：100pg；5：1ng；6：10ng7：100ng； 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。 

实施例1 

(1)设计病毒特异引物： 

上游引物P1：5’-CGTCTCATTGGAGATGAACG-3’；