[发明专利]一种高效表达重组人凝血八因子的方法

权利要求书

1.一种高效表达重组人凝血八因子的方法，为将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1～10:1。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述表达重组人凝血八因子的细胞培养液为无血清细胞培养液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）表达细胞的准备：表达人凝血八因子的细胞株的构建或者表达人凝血八因子的冻存细胞的复苏；

2）表达细胞的扩种培养：将步骤1）构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到无血清培养基中，振荡培养3～4天，至细胞密度达到1～2×10⁶cells/ml，细胞传代，振荡培养扩增至细胞密度达到1～2×10⁶cells/ml，获得种子液；

3）细胞反应器培养：将步骤2）获得的种子液接种到细胞反应器的无血清培养基中，培养4～7天，使细胞液的细胞密度达到1～5×10⁶cells/ml；然后向细胞液中加入外源VWF并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液；所述补料培养过程中，控制细胞液中VWF活性与FVIII活性比为1～10:1；

4）凝血八因子产品的制备：对细胞原液进行离心、过滤、纯化处理，获得重组人凝血八因子产品。

4.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤2）中构建或复苏的人凝血八因子表达细胞以1～9×10⁵cells/ml的接种量进行接种。

5.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤2）中所述细胞传代是以1:2～4的传代比例传代。

6.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤2）中振荡培养的条件为：转速60～150转/分钟，培养温度32～38℃。

7.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3）种子液接种到细胞反应器的接种量为5～10v/v%。

8.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3）所述补料培养的条件为：补料培养过程中控制溶氧40～80％，pH6.8～7.2，搅拌转速40～90转/分钟，培养温度32～38℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在0.5～1.5g/L。

9.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3）反应器培养得到的所述细胞原液的细胞密度为1～2×10⁷cells/ml。

10.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于，步骤3）在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为2～3:1。