[发明专利]测定烟草中咖啡酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及烟草的种植与栽培，具体来说，涉及测定烟草中咖啡酸含量的方法。

背景技术

咖啡酸，又名3,4-二羟基肉桂酸或3,4-二羟基苯丙烯酸（3,4-dihydroxy-cinnamic acid）， 黄色结晶，是烟草中苯丙烷代谢途径的中间产物，也是木质素合成途径代谢产物，主要以葡萄糖苷和酯的形式存在，是烟草中的酚类物质。烟草酚类化合物是产生烟草香气的重要成分之一，不仅直接影响烟叶颜色，对烟气质量和香吃味也有间接影响，其降解产物还可以改善烟草制品的吸味，是衡量烟叶品质的重要指标。因此，测定烟草中的咖啡酸含量对于判断烟叶的质量和风格特征有着重要的意义。

经过检索，中国专利数据库中未发现关于烟草中咖啡酸测定方法的专利，而现有的技术文献也鲜有相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供测定烟草中咖啡酸含量的方法，以为探明烟叶特色形成提供一些理论支持。

本发明提供的测定烟草中咖啡酸含量的方法，是采用超高效液相色谱法测定烟草中咖啡酸含量，包括以下步骤：

第一步 制备咖啡酸标准品

准确称取咖啡酸标准品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸1 mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液，备用；

第二步 制备供试样品溶液

（1）制备鲜烟叶样品：液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重（无水分），再将其研磨成粉，备用；

（2）制备烤后烟叶样品：烤后烟叶粉碎过40目筛，备用；

（3）提取咖啡酸：取鲜烟叶粉末0.6g或干烟叶粉末0.05g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入4mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22μm的滤膜后进样；

 第三步  测定咖啡酸含量

分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量。

上述咖啡酸标准品购自Sigma公司，纯度≥98％；上述乙腈、乙酸为天地公司生产的色谱纯试剂，氢氧化钠、盐酸、无水硫酸钠、乙醚、乙酸乙酯为国产分析纯。

上述检测烟叶色谱的色谱条件是：色谱柱用Waters C18 ODS2色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）；流动相A为水，B为乙腈，C为10%乙酸水溶液，梯度洗脱，柱温35℃，流速1.0mL.min^-1，检测波长310nm，进样量2μL。

上述梯度洗脱条件如下

时间ABC初始75%5%20%30min50%30%20%35min75%5%20%