[发明专利]调节核酸的甲基化/去甲基化状态的方法和试剂

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和药学领域；更具体地，本发明涉及调节核酸的甲基化/去甲基化状态的方法和试剂。

背景技术

在表观调控中，现在机制了解最清楚的是胞嘧啶第5位的甲基化。胞嘧啶甲基化直接参与到了转录调控和基因组的其他调控过程中。因为胞嘧啶的甲基化会引起染色体的压缩和基因的沉默，所以对于活跃表达的基因来说，它们的启动子和促进子区域的DNA往往处于低甲基化水平状态。因此，DNA的去甲基化对于沉默基因的转录激活也起到了重要作用。

现在，特定基因位点的去甲基化和基因组规模的去甲基化都已有报道。例如，雌激素受体的目标基因pS2的启动子区域在基因的沉默和表达循环过程中是存在主动去甲基化的。对于基因组规模的去甲基化，这种现象在原始生殖细胞中出现，被认为对于擦除父母甲基化模式并在生殖细胞中建立配子特异的甲基化谱式起到重要作用；在受精后，精子基因组的重塑也伴随着父源基因组的大规模去甲基化，这种现象很可能对于早期胚胎的发育是重要的。现在，对于主动的去甲基化机制有多种解释，包括打开C-C键直接将甲基基团从甲基胞嘧啶上切除，酶促反应将甲基基团以甲醛的形式从5hmC上移除，以及通过DNA剪切修复途径(BER和NER)将甲基胞嘧啶直接替换。但是，现在还没有任何一种途径通过生物化学或者遗传的操作在哺乳动物中得到验证。理论上讲，这些途径都可以被Tet氧化5mC为5hmC来启动。基于5hmC在干细胞生物学和癌症中的重要性，近年来Tet介导的羟甲基化的研究是一个热点。已经有多项证据显示Tet1的功能可以逆转起始性的DNA甲基化。但是，DNA的去甲基化即如何将甲基化的胞嘧啶逆转成胞嘧啶是如何实现的依然未知。

因此，研究DNA的甲基化/去甲基化机制，找到调节DNA的甲基化/去甲基化的关键分子或方法，是本领域人员需要进一步探索的，有助于从根本上了解DNA的修饰或变异。

发明内容

本发明的目的在于提供调节核酸的甲基化/去甲基化状态的方法和试剂。

在本发明的第一方面，提供一种DNA去甲基化的方法，包括：

(1)以Tet双加氧酶处理DNA，将DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)转变为5-羧基胞嘧啶(5caC)；

(2)以胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)处理步骤(1)获得的DNA，将DNA中5-羧基胞嘧啶切除。

(3)通过DNA剪切修复途径(BER或NER)，在5-羧基胞嘧啶切除位点加上非甲基化的胞嘧啶。

在一个优选例中，步骤(2)中：

以胸腺嘧啶DNA糖基化酶处理DNA的同时，还加入GADD45A(Growth arrest and DNA-damage-inducible 45，alpha)。

在一个优选例中，所述的方法为非(疾病)治疗方法，以及非(疾病)诊断方法。

在另一优选例中，所述的方法是体外方法。

在另一优选例中，所述方法还包括：

在本发明的另一方面，提供一种将DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)转变为5-羧基胞嘧啶(5caC)的方法，包括：以Tet双加氧酶处理DNA。(较佳地，所述方法为非治疗性和非诊断性的)。

在另一优选例中，在以Tet双加氧酶处理DNA时，还包括加入Fe²⁺和/或2-酮戊二酸；或加入可形成(如通过水解)Fe²⁺和/或2-酮戊二酸的物质。

在另一优选例中，以胸腺嘧啶DNA糖基化酶处理DNA的同时，还加入GADD45A。

在本发明的另一方面，提供一种将DNA中5-羧基胞嘧啶切除的方法，包括：以胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)处理DNA。较佳地，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

在本发明的另一方面，提供Tet双加氧酶或其促进剂的用途，用于将DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)转变为5-羧基胞嘧啶(5caC)；或用于制备将DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)转变为5-羧基胞嘧啶(5caC)的组合物。较佳地，所述用途为非治疗性和非诊断性的。

在另一优选例中，所述的Tet双加氧酶包括：Tet1、Tet2或Tet3或它们的保留催化结构域并具有催化活性的片段或衍生物(如Tet1CD、Tet2CD或Tet3CD)。