[发明专利]硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置

权利要求书

1.一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将膜组织在-20～-80℃温度下冷冻2～24小时后，于室温下解冻，如此反复冻融1～3次；所述的膜组织为哺乳动物的心包膜、腹膜、隔膜、硬脑膜和小肠黏膜的任一种；

步骤二、将冻融后的膜组织采用辗压破裂细胞，辗压是以空气或是液体为环境媒介进行；辗压压力为5MPa～50Mpa；

步骤三、将辗压后的膜组织进行交联固定保护：对膜组织的疏松面不交联，或是以＜2小时的紫外光照射交联；对膜组织的致密面，采用物理交联或化学交联、或是二者复合方式；其中：物理交联为2～12小时的紫外光照射，或是采用乙醇、或丙酮、或异丙醇的脱水交联；化学交联是采用HDI、或DPPA、或NDGA、或EDC、或EC及其低聚物、或聚乙二醇为化学交联剂，或是采用葡萄糖、或核糖为生物交联剂，进行交联反应；

步骤四、脱细胞去抗原：对交联后膜组织的两个表面采用不同方式脱细胞去抗原处理，对疏松面的处理强度相对致密面要温和；

步骤五、致密面的纤维化修饰：采用磷酸盐与碱的混合溶液对膜组织致密面进行纤维化修饰处理；所述的磷酸盐为磷酸氢二钠或磷酸钾，浓度为0.1～0.5M，所述的碱为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙、或是氨水，浓度为0.01～0.1M；所述的混合溶液pH≥11，处理温度2～25℃，处理时间6～48小时；得到硬脑/脊膜移植替代物产品；在混合溶液处理后，允许再采用丙酮、乙醇、异丙醇有机试剂进行致密化处理；

步骤六、包装及灭菌：将所得产品经干燥、裁切、包装、灭菌后储存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，辗压压力为10MPa～20Mpa；所述液体媒介为纯化水、生理盐水、PBS缓冲液或是Tris缓冲液的任一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，物理交联的紫外光照射为4～6小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，化学交联剂为EDC或D-核糖；采用EDC的交联方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与磷酸盐缓冲液的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的30～50％；以NHS为稳定剂，EDC的浓度为5mM～20mM，NHS的用量是EDC的1/4～1/3，交联温度为2～10℃，交联时间16～36h；采用D-核糖的交联方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与水的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的60～80％，交联剂浓度为0.3mM～3mM，交联温度20～40℃，交联时间3～15天。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中脱细胞去抗原的处理为：

对于膜组织的致密面，采用酸溶液、或碱溶液、或盐溶液、或酶溶液、或双氧水溶液，或是丙酮、异丙醇、乙醇的任一种溶剂进行脱细胞去抗原处理；其中，酸溶液为盐酸或硫酸，浓度为0.5～2M，处理时间1～12h；碱溶液为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙，浓度为0.5～2M，处理时间1～12h；盐溶液为氯化钠或氯化钾，浓度为1～3M，处理时间0.5～2h；酶溶液为活力≥250U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力≥50KU/mL的RNA酶溶液、或活力≥15KU/mL的DNA酶溶液，处理时间8～24h；双氧水溶液的体积浓度为2％～30％，处理时间1～6h；丙酮、异丙醇、乙醇均采用纯试剂；

对于膜组织的疏松面，采用低渗溶液，或弱酸溶液、或弱碱溶液、或酶溶液、或是SDS、或Triton、或EDTA进行脱细胞去抗原处理；其中，低渗溶液为10～100mM的Tris缓冲液、或是浓度低于9g/l的盐溶液，处理时间2～24h；弱酸溶液为醋酸、或柠檬酸、或乳酸，浓度0.1～0.5M，处理时间1～12h；弱碱溶液为碳酸钠、或碳酸氢钠、或碳酸钾、或碳酸氢钾，质量浓度为0.25～1％，处理时间1～12h；酶溶液为活力≥25U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力≥5KU/mL的RNA酶溶液、或活力≥1.5KU/mL的DNA酶溶液，处理时间8～24h；SDS溶液的浓度为5g/L～20g/L，处理时间12～48h；Triton溶液的浓度为1g/L～10g/L，处理时间12～24h；EDTA溶液的浓度为1g/L10g/L，处理时间0.5～6h。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述对于致密面和疏松面处理为单次或是多次处理，允许多种试剂的联合处理或交替处理。