[发明专利]一种快速筛选和制备香料的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种快速筛选和制备香料的方法，特别是涉及一种基于细胞毒性检测技术及提取分离技术快速筛选和制备安全的香料的方法。属香料的研究与开发领域。 

背景技术：

食用香料有1700种以上，是食品添加剂中最大的家族，其中，约有1300种是从人类普遍食用的香料植物中提取出的天然物质，在特殊或普遍的地区有安全的食用历史。由于这些物质的使用量较小且挥发性较强，很难对人体造成损害，因而大多数的天然食用香料都被认为是安全的（GRAS类物质）。人们在食品中大量使用这些物质而没有考虑其安全性，事实上，这类香料的毒性特别是慢性毒性没有被很好地研究。例如，将黄樟素（Safrole）用作香料添加剂已有60多年的历史。美国FDA发现无论是从黄樟中提取的，还是来自化学合成的黄樟素都可使大鼠患肝瘤。所以对香料的安全性评价研究非常必要。 

毒理学安全性评价的第一步工作是急性毒性试验，经典的急性经口毒性试验虽然可较精确的测量LD50值，但以死亡为观察终点。一般需耗用40-80只动物(大鼠或小鼠等) ， 观察时间至少为14d。随着近年3R原则(减少Reduction，优化Refinement，替代 Replacement )的提出和人类对动物福利的关注，以动物模式为基础的毒理学安全性评价系统和方法逐渐受到挑战。以体外毒理学测试技术代替整体动物的毒理学安全性评价是当今毒理学测试方法发展的趋势。 

检测化学品细胞毒性的常用方法有中性红摄入法和MTT法。中性红摄入法细胞毒性试验的原理是：中性红(neutral red) 一种阳离子活性染料，以离子扩散方式进人细胞膜并与溶酶体基质的阴离子部分结合。中性红染料的摄入、转运和贮存依赖于活性生物过程，需要能量、完整溶酶体。这些系统中的任何损伤，或者由于细胞死亡导致的细胞数减少意味着中性红摄入减少，正常生长的细胞具有摄取中性红的能力，当细胞膜和溶酶体膜中毒损伤时就会导致中性红的进人下降。细胞中性红的摄入量与活细胞数量成正比。 

中性红细胞毒性试验不使用动物，试验周期为3天，有效的减少了动物的使用量及缩短了试验周期，且该试验较灵敏准确、结果稳定、操作简便、重复性好，是检测细胞 毒性常用的方法。 故本发明采用中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cell，简称CHO细胞）的中性红摄入试验来筛选和制备安全性香料，用于香料的细胞毒性的快速初步研判，了解香料初提物的安全性；并在其指导下，通过现代提取分离技术，最终制备得到安全可用的香料。 

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种快速筛选和制备香料的方法。

本发明的一种快速筛选和制备香料的方法，将现有的体外细胞毒性检测法和提取分离技术组合，用于快速筛选和制备香料；具体的步骤如下： 

a.用中性红摄入法或MTT法对香料初浸膏进行体外细胞毒性检测； 

b.根据细胞毒性检测结果判断香料初浸膏的细胞毒性： 

根据细胞相对增殖率RGR进行细胞毒性分级，当香料初浸膏的细胞毒性为0级和1级，该香料初浸膏样品通过细胞毒性的初筛； 

当香料初浸膏的细胞毒性大于2级，则采用现有提取分离技术，用不同极性的溶剂，通过萃取技术，把香料初浸膏分成不同极性的提取物；或者采用不同极性的溶剂直接提取香原料，得到不同极性的提取物；或者采用超临界流体技术对香原料萃取得到天然香料超临界二氧化碳萃取物。 

c. 对各部分提取物分别进行体外细胞毒性检测，找到细胞毒性的主要来源；通过现有提取分离技术，去除有毒部分，制备得到安全的香料。 

本发明的特点在于： 

1、采用体外细胞毒性试验方法来筛选天然香料，符合3R原则，不使用动物，试验周期为3天。与经典的急性经口毒性试验相比，能有效的减少动物的使用量和饲养所需的人力物力，减轻活体动物的痛苦，缩短试验周期，降低试验成本，提高检测效率； 

2、在细胞毒性测试技术的指导下，利用现代提取分离技术，找到细胞毒性的主要来源，并通过现有提取分离技术，得到安全可用的香料。 

3、该方法能够降低香料的开发成本和开发周期。 

附图说明：

附图显示灵香草浸膏不同溶剂萃取部分的中性红细胞毒性试验结果。 

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。 

实施例一： 

1实验部分 

1.1  仪器与材料