[发明专利]一种固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过固定化酶法生产γ-氨基丁酸的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸是一种具有很高生理活性的天然氨基酸，广泛分布于动植物中。是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动。根据目前的研究，发现γ-氨基丁酸的生理活性主要表现在以下几方面：（1）镇静神经、抗焦虑；（2）降低血压；（3）治疗帕金森病、癫痫、老年痴呆等疾病；（4）降低血氨，以解决氨毒，从而增进肝机能；（5）提高脑活力；（6）促进乙醇代谢；（7）其他如防止皮肤老化、消除体臭、改善脂质代谢、防止动脉硬化高效减肥等功能。γ-氨基丁酸目前在医药中已有广泛的应用，同时作为一种具有显著药理作用的功能性因子，其在食品工业中的应用也越来越受关注。

由于γ-氨基丁酸在动植物原料中含量很低，很难直接从天然组织中大量提取得到，目前γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。但是，化学合成法得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂，因此化学合成法制备的γ-氨基丁酸不宜用于食品添加剂使用。

生物合成法主要是利用酶催化转化，在γ-氨基丁酸支路中合成。该方法生产成本低、无毒、安全环保，属于低碳、绿色生产方式。就酶源而言，可分为两种途径：植物组织代谢和微生物发酵。其中，植物组织代谢主要利用内源酶转化制备γ-氨基丁酸，分为植物组织生长代谢和立体植物组织应激代谢两种方式。微生物发酵法主要是利用谷氨酸脱羧酶（GAD）生物催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸。至今为止，被发现具有GAD活性并用来制备γ-氨基丁酸的微生物主要包括大肠杆菌E.coli、乳酸菌、酵母菌、红曲霉菌等，表1是目前微生物生产γ-氨基丁酸的情况。

表1微生物生产γ-氨基丁酸的研究概况

目前，生物合成法是γ-氨基丁酸的主流生产技术，综合比较国内外生物合成法生产γ-氨基丁酸,不同菌株及不同的生产方式,γ-氨基丁酸的产量差别较大，且发酵周期均较长，发酵结束后如何将产物从成分复杂的发酵液分离、纯化，也成为生产流程中复杂、耗时、增加成本的一环。近年来，随着酶固定化技术在医药工业的发展应用，有关固定化GAD转化γ-氨基丁酸的研究也已有报道，吴国琪等（分析化学，1999，27（7）：759-763采用羧甲基化的烯丙基葡聚糖生化树脂，林少琴等（药物生物技术，2005，12（2）：101-105）采用壳聚糖材料固定GAD，陈蔚青等人（中国生化药物杂志，2007，28（4）：224-227）采用海藻酸钠与明胶协同作用固定化，以海藻酸钠和明胶为载体，通过氯化钙硬化、戊二醛交联，对大肠杆菌GAD进行包埋法固定化，并尝试采用填充床反应器连续反应制备γ-氨基丁酸，但反应效率还有待改进提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的绿色合成方法。

本发明方法涉及基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD和BL21(DE3)-pET21(+)-GAD，以底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸出发，经表达的谷氨酸脱羧酶或者固定化的基因工程菌表达的谷氨酸脱羧酶直接转化L-谷氨酸钠或L-谷氨酸，制备γ-氨基丁酸。

本发明所述的固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的具体方法是：

以固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶（简称“固定化酶”）融合蛋白为酶源，浓度为0.05mM~0.15mM的磷酸吡哆醛存在的条件下，进行酶促反应，反应过程中，向反应体系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸为20g/L至50g/L，温度25至50℃，pH值为4至6，经酶法转化反应1h至4h生产γ-氨基丁酸，并进一步分离获得γ-氨基丁酸粉末或晶体。

酶促反应优选转化温度为37℃；优选转化pH值为5.5；优选转化时间为2h；底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸的用量优选分别为40g/L；辅酶磷酸吡哆醛浓度为0.1mM；固定化酶优选用量为8mL/L。

固定化酶源可重复使用15次以上，且在最佳的反应条件和体系下，连续转化10次，其催化底物转化率均能够达93%以上。

所述的固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白的制备方法是：