[发明专利]禽传染性支气管炎病毒H120毒株的PCR检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及禽类病毒检测技术领域，具体涉及禽传染性支气管炎病毒H120毒株的PCR检测引物及检测方法。

背景技术

禽传染性支气管炎（IB）是由禽传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病。在规模化饲养条件下，禽传染性支气管炎感染率很高，该病的死亡率为10~30%，每年造成的经济损失超过十亿元。H120株是最早应用于预防IB的弱毒疫苗，也是目前应用最为广泛的IBV弱毒疫苗之一，基因分型属于IBV第Ⅴ分支，其安全性好，毒力稳定。

由于生产中常用的禽传染性支气管炎疫苗一般为新支二联弱毒活苗，家禽体内在一段时间内都存在疫苗毒的活毒，因此临床上分离到的IBV有可能是疫苗毒，也有可能是野毒株。现阶段对于疫苗株和野生病毒株的区分方法是经过RT-PCR，扩增所得产物直接测序或者经过克隆之后测序，再经过序列分析才能得出结果，通常需要3~7天的时间，给IBV的快速检测带来不便。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供可以快速区分IBV 120株与其他野生株的RT-PCR引物。

本发明的另一目的是提供一种IBV 120株的RT-PCR检测方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测引物，有两对，引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1~2和SEQ ID NO:3~4。这两对引物是根据IBV H120毒株序列（Genbank：FJ888351）分别在S1基因和3’-LTR基因设计的。

一种禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法，是以待检样品RNA为模板，用权利要求1所述的两对引物进行RT-PCR扩增，如果扩增产物片段分别为653bp和230bp，则待检样品中有禽传染性支气管炎病毒H120毒株。

上述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法中，PCR反应体系含有一步法PCR混合酶（PrimeScipt 1 Step Enzyme Mix）、缓冲液（2×1 Step Buffer）、SEQ ID NO:1~4所示引物、样品RNA和无RNA酶的水（RNase Free）。

上述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法中，RT-PCR的反应程序优选为：

（1）逆转录：50℃ 30min；

（2）预变性：92℃ 4min；

（3）变性：94℃ 30sec；退火：55℃ 30sec；延伸：72℃ 45sec；共进行30个循环；

（4）延伸：72℃10min。（min表示分钟，sec表示秒）。

上述禽传染性支气管炎病毒H120毒株的RT-PCR检测方法，扩增的653bp目的片段为S1基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:5；230bp的目的片段为3’UTR基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的引物特异性高，且片段小，整个RT-PCR过程可以在2~2.5小时内完成，不需要经过测序公司测序就能快速鉴定出IBV的H120疫苗毒株，为临床检测节省大量时间。

附图说明

图1. RT-PCR检测野生毒株和疫苗株电泳结果，其中D为大华农新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（购自广东大华农动物保健品股份有限公司；生产批号：201136）；1：第五分支野毒；M：DL2000 Marker。

图2. RT-PCR特异性验证电泳结果，其中1-4：第一分支野毒；5-8：第二分支野毒；9-12：第三分支野毒；13-16：第四分支野毒；17-20：第五分支野毒；M：100bp Marker；D：大华农新支二联苗；H：哈兽研新支二联苗；N：阴性对照。

具体实施方式

实施例1

1 试验材料

1.1 主要试剂与仪器

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒（Cat No.：AP-MN-BF-VNA-250），TaKaRa PrimeScript 0ne step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa Code:DRR055A)，Thermo高速低温离心机，Thermo PCR仪。

1.2 毒株