[发明专利]等温扩增检测猴痘病毒的试剂及等温扩增检测猴痘病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测猴痘病毒的试剂及方法，尤其涉及利用等温扩增技术检测猴痘病毒的试剂和方法。 

背景技术

猴痘病毒是一种人畜共患病，多发于中非和西非，1958年首次发现于猴子体内，上世纪70年代首次发现于人类感染猴痘病毒，2003年曾在美国威斯康辛州爆发，造成82人感染。猴痘病毒为双链DNA病毒，与天花病毒同属痘病毒科，感染的症状与天花相似，如发热、头痛、淋巴结肿大、咳嗽和全身极度疼痛，俗称“猴天花”，为未输入我国的危险病毒之一，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液传播，毒力强的病毒株有可能致死。天花疫苗对猴痘病毒有一定的抵抗能力，目前30岁以下人群均未接种天花疫苗，一旦猴痘病毒传入将造成极大的危害。因此建立快速的猴痘病毒检测方法具有重要的现实意义。 

环介导等温扩增技术是一种高效、特异且不需要特殊仪器的核酸检测手段，针对靶基因的6个特征区域设计4种引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。它的产物是由多重复靶序列的茎-环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP所特有的阶梯状条带。LAMP反应过程将产生大量的焦磷酸根离子，与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据快速离心或者浊度变化，直观观察检测结果，在基层或者落后地区技术人员只需简单培训就可完成实验操作。 

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂，可以用于快速准确地检测猴痘病毒。 

为此，本发明采用以下技术方案：它包括： 

（1）检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列为CCTCTCTCATTGATTTTTCGCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGCATCAGAATCTGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATTGTCGTAGACCAACGAGGAGGAGTATCGTCGGAACTGTACACCATAGTACTACGTTGAAGATCATACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTTCTCCATATTAAGTTGTTTAGTTAGTTGTGCAGTAGCTCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGCACACAATCTCTGTGTCAGAACGCTCGTCAATATAGATCGTAGAAATTTTTTAGAGAGAACTAACACAACTAGCAATAAAACTGATCTTATTTTATCATTTTTTTATTCATCATCCTCTGGTGGTTCGTCGTTCCTATCGAATGTAGCTCTGATTAACCCGTCATCTATAGGTGATGCTGGTTCTGGAGATTCTGGAGGAGATGGATTATTAT，如序列表SEQ NO:1所示； 

（2）引物，其基因碱基序列： 

外引物F3：5′-CATTGATTTTTCGCGGGATA-3′； 

外引物B3：5′-TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3′； 

内引物FIP： 

5′-GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3′； 

内引物BIP： 

5′-TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3′。 

本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种等温扩增检测猴痘病毒的方法，可以快速准确地检测猴痘病毒。 

为此，本发明采用以下技术方案： 

它的反应体系25μl，包括10×buffer2.5μl，引物混合物1μl，模板DNA1μl， 8U BstDNA聚合酶0.8μl，甜菜碱（8M）2μl，dNTP(10mM)2μl，MgSO₄(100mM)1.2μl，1.25μl荧光染料20×Eva Green，加入ddH₂O补足25μl；反应体系中引物终浓度分别如下：外引物F3和外引物B3各40pM，内引物FIP和内引物BIP各800pM； 

将上述反应体系在水浴箱上63℃90分钟，或者在荧光定量PCR仪上63℃1分钟，90个循环，同时进行待测样本、阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用权利要求1所述的检测猴痘病毒的标准品；