[发明专利]一种含G2A基因的重组质粒及构建方法

说明书

    技术领域

    本发明属于真核表达载体构建领域，尤其涉及一种含G2A基因的重组质粒及构建方法。

    背景技术 

    孤儿G蛋白偶联受体(G2A, for G2 accumulation)是G蛋白偶联受体家族，OGR1亚家族（包括OGR1, G2A, TDAG8, GPR4）成员之一，因其能够诱导细胞停滞在G₂/M期，并修复受损的DNA而得名。G2A在人类基因库RPCI-11片段40119-35358碱基位点，编码382个氨基酸肽链，具有高度保守结构，七个疏水结构组成跨膜α螺旋(TM1-TM7)。Weng Z等1998年鉴定得到在前B细胞和成纤维细胞G₂/M检验点积累的G2A可以通过减弱BCR-ABL的转变能力来发挥抑制细胞增殖的作用，而敲除G2A基因的小鼠则表现出系统性红斑狼疮和动脉粥样硬化病变。现在普遍认为动脉粥样硬化与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的吞噬、泡沫细胞的形成和相关细胞信号转导作用下单核细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的反应有密切关系。溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)作为ox-LDL的主要脂质成分，已经有研究表明它可以与G2A高亲和力结合，介导细胞迁移，并作为分子伴侣协助G2A的表达。此外，动脉硬化病灶部位为酸性微环境，Murakami等报道，G2A 的过表达在酸性环境下可导致肌醇磷酸的产生，而G2A的质子感知能力为LPC所拮抗。为进一步研究G2A怎样介导动脉粥样硬化等炎症反应，探究其质子感知特性，现有技术需要克隆G2A基因并构建真核表达载体，为下一步考察其下游细胞应答奠定基础。

    发明内容

    本发明提供了一种供研究G2A介导动脉粥样硬化等炎症反应并探究其质子感知特性的含有G2A基因的重组质粒。

本发明的另外一个目的是提供了构建含有G2A基因的重组质粒的方法。

概括的说，本发明设计了一对针对 G2A 基因的引物，从人脐静脉内皮细胞提取总 RNA，反转录获得的 cDNA 中克隆不含终止密码子的 G2A 基因并亚克隆到 pMD-19T 载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体pEGFP-N3用HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pEGFP-N3-G2A，并测序鉴定；重组载体以lipofectamine2000介导转染293T细胞。Real time PCR法检测外源基因在293T细胞中的表达。 下面具体的说明本发明的详细技术方案：

    本发明的含G2A基因的重组质粒，其包括载体片段pEGFP-N3和基因片段G2A。

    本发明的G2A基因片段（不含终止密码子）来自人脐静脉内皮细胞（HUVECs）提取总RNA，反转录获得的cDNA中PCR扩增得到的；载体片段pEGFP-N3来自质粒pEGFP-N3。

    本发明的含G2A基因的重组质粒的构建方法包括如下步骤：

（1）PCR扩增获得G2A基因；

（2）将含有pEGFP-N3片段的载体与步骤（1）获得的含G2A基因的PCR产物酶切后连接；

（3）将步骤（2）获得的连接产物转化受体菌；

（4）检测外源基因在293T细胞中的表达。。

    进一步的说，步骤（1）包含通过PCR从HUVECs总RNA反转录得到的cDNA中获得 G2A基因；

进一步的说，步骤（1）中的PCR扩增中使用PCR引物5'-AAGCTTATGTGCCCAATGCTACTGAA-3'

和5'-GGATCCGCAGGACTCCTCAATCAGCC-3'。

    进一步的说，步骤（2）中所述含有pEGFP-N3的载体为质粒pEGFP-N3。

    进一步的说，步骤（2）中采用HindⅢ和BamHⅠ酶对含有pEGFP-N3片段的载体与步骤（1）获得的含G2A的基因的PCR产物进行酶切。