[发明专利]香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物病害的分子生物学检测领域，具体涉及一种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测引物及其应用。

背景技术

由尖镰孢菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性土传病害，也是我国进口检疫对象之一。1904年在美国夏威夷首次报道发现该病害，1910年在巴拿马因该病造成重大损失，目前该病害已广泛分布世界产香蕉国家。我国大陆于1960年在广西的西贡蕉上首先发现该病，不久国内各重要焦区都相继发生此病害，近年来在福建也发现香蕉枯萎病，并且有继续扩展蔓延的态势。其侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤。该病菌可通过病株残体、耕作工具、带菌土壤以及病区灌溉水、雨水、虫等进行近距离传播蔓延，带病菌的吸芽、土壤及二级苗是远距离传播的方式。据报道香蕉枯萎病菌有4个生理小种，其中以1号小种和4号小种对生产造成严重危害。

近年来，随着农产品贸易及海峡两岸农业交流的发展，从香蕉枯萎病疫区国家或地区引进农产品及种苗的种类和数量迅速增加，香蕉枯萎病菌也随着这些植物产品及植物在贸易中传入，并对我国农业发展和农产品贸易构成了严重的威胁。目前，防治香蕉枯萎病的方法主要是加强检测、检疫，严防带病种苗进入无疫区，推广种植无病组培苗，定期检查蕉园，发现零星病株应及时清除销毁，并撒施石灰或尿素处理土壤；种植抗病和耐病的香蕉品种；重病区则应轮作其它作物如水稻、花生、甘蔗等经济作物。该病害的检疫检测技术是以往研究中的薄弱环节，因此，国内外目前仍无十分有效的办法控制香蕉枯萎病扩散蔓延为害，同时，无病种苗生产基地的建设对于无疫区农作物，尤其是果树等多年生作物香蕉枯萎病的防治至关重要，因此为了及时堵截国外病原菌的传入，防止香蕉枯萎病从疫区传入非疫区，建立一套稳定、可靠、简便、快速、灵敏的分子检测方法对香蕉苗及种植地区土壤进行检测和监测是十分必要的。

传统的植物病原的检疫检测技术由于简便、易行，目前仍被采用，但由于灵敏度低和耗时长，已经不能满足新形势下植物病害诊断和病害控制工作的需要，迫切需要新型检测技术与之配套。近年来各国均致力于分子生物学检测技术的研究，取得了很大的进展，其中以多聚酶链式反应（PCR）技术为基础的病原检测方法已经成功应用于多种植物病原的检测和鉴定。植物病原生物的PCR分子检测技术是当前该领域的发展方向，许多重要病原生物都已经建立了分子检测技术，越来越多的分子检测试剂盒已经或正在被研制。由于客观原因，我国虽然在植物病原生物分子检测技术方面起步较晚，但目前也研制出了许多用于植物病原生物检测的技术，尤其是一些拥有自主知识产权的检测方法，并将之投入到商业生产和应用中。

目前已有一些利用分子手段鉴定香蕉枯萎病菌，即尖镰孢菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp. cubense）的方法，John A.等报道了香蕉枯萎病菌基于多重PCR的分子检测；廖林凤等报道了用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，从90个RAPD随机引物中筛选出引物进行RAPD-PCR扩增，并设计特定引物作为香蕉枯萎病菌4号小种的特异性SCAR标记；刘景梅等用RAPD技术,从200条随机引物中筛选出8条引物可产生生理小种RAPD标记12个,根据这些特异片段序列分别设计相应的SCAR引物,通过对18个菌株的PCR扩增检验,有4个RAPD标记成功地转化为SCAR标记,其中Race 1-SCAR标记1个、Race 4-SCAR标记2个、同时能鉴定出 2个小种的SCAR标记1个；吕伟成等对香蕉枯萎病菌遗传多样性进行分析，构建了香蕉枯萎病菌生理小种ITS-SCAR双重PCR检测体系，该方法可以同时检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种；叶建军等构建了以ITS测序与SCAR分子标记相结合的香蕉病原菌FOC4分子检测方法；王国芬、叶明珍、漆艳香、陈静华等根据ITS序列、16SrDNA序列、β-微管蛋白基因(β-tubulin)保守序列等设计特异引物检测香蕉枯萎病菌。

目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以进行，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。