[发明专利]血清DKK1在制备早期肝细胞癌或小肝细胞癌的诊断试剂中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及血清DKK1在制备早期肝细胞癌或小肝细胞癌的诊断试剂中的用途。 

背景技术

肝脏原发性肿瘤包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌、混合性肝细胞癌、胆管囊腺瘤、肝母细胞瘤、血管瘤、类癌、淋巴癌、上皮样血管内皮瘤、鳞状细胞癌、畸胎瘤、以及平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤等其它肝脏肉瘤。肝细胞癌(HCC)是其中一种组织学亚型。目前，肝细胞癌的病因尚未完全明确，其发生是一个涉及多因素、多阶段和多基因累积变异的过程，主要的因素有病毒感染、黄曲霉毒素的摄入、酒精中毒、水污染、肝螺旋杆菌以及肝硬化等。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝细胞癌的主要致病因素，尤其是在亚洲和非洲；丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈世界性分布，是欧美等西方国家肝细胞癌发病率升高的主要因素。肝硬化是肝细胞癌发生最危险的因素，也是肝硬化病人主要的死因。由于大多数肝细胞癌患者就诊时已属中晚期，失去了最佳治疗时机，目前仅有30-40%的肝细胞癌患者能实施有效手术治疗，五年生存率仅有3-5%。所以及时有效的诊断肝细胞癌是提高患者生存率的关键之一。 

目前，筛查和诊断肝细胞癌最常用的方法是影像学和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)检测。影像包括超声、CT、MRI等，但影像检测花费昂贵，难以广泛应用，且易受操作者经验影响，而且难以区分肝癌和非恶性增生。AFP是当前全世界应用最广泛的肝细胞癌标志物。当其界值为20ng/mL时，AFP诊断肝细胞癌的灵敏度仅为55-60%，产生约40%的假阴性率；且其诊断小肝癌的能力更低，灵敏性降为25-52%，大部分早期肝细胞癌患者AFP均无明显升高。这部分AFP阴性肝细胞癌病人在临床上难以诊断，难以评估其治疗效果和疾病进程。因此发现新的可靠的能早期诊断肝细胞癌的标志物，可 极大提高和改善临床综合治疗效果，有助于肝细胞癌患者生存期的延长和生存质量的提高。理想的肿瘤标志物需要有较高的特异性，能够将肝细胞癌与肝炎、肝硬化、肝脏再生结节等区别开来，同时还需有较高的灵敏度，能够诊断早期肝细胞癌，且具有易检测、可重复、非侵入性的特点。 

人类基因组计划的完成，高通量基因表达检测方法的发展和大规模数据分析能力的提高，使人们可以更深入地研究肝细胞癌发生发展过程中基因表达的改变，更好地理解肝细胞癌的发病机制，筛选有望应用于临床的生物标志物和药物靶点。本实验室前期通过cDNA表达谱芯片(Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus 2.0Array)技术分析了肝细胞癌患者癌组织及对应癌旁肝组织基因表达谱的差异。进一步发现DKK1在正常成年人的多种组织中不表达，仅在胎盘组织中表达，具有肿瘤特异性。 

DKK1是Wnt信号通路的抑制因子，最早克隆于1998年，发现其在非洲爪蟾早期发育中能够抑制Wnt诱导的轴的复制而参与头部的形成。Wnt通路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞极性和运动等过程，其通路中信号分子的突变或异常表达与多种疾病及癌症相关。该信号通路与肝细胞癌的发生发展也密切相关。Wnt通路受几种分泌蛋白的调控，包括DKK、WIF(Wnt-inhibitor factor)和SFRP(secreted frizzled related protein)等。DKK家族包含进化上相对保守的4个成员(DKK1-4)。DKK1编码一个分泌型糖蛋白，含有两个富含半胱氨酸的保守区域(Cys1、Cys2)，能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)结合，并在膜蛋白Kremen1/2参与下通过引起LRP5/6内吞,抑制Wnt-Frizzled-LRP5/6复合体的形成，而抑制经典的Wnt信号通路。 

随后本发明人采用ELISA方法，首次在10种不同类型人肿瘤细胞培养上清中检测出高浓度的DKK1蛋白，提示多种人肿瘤细胞分泌和高表达DKK1，DKK1可用于人类恶性肿瘤的临床血清诊断。于是2005年本发明人申报了国家发明专利(CN200510110298.2)和国际PCT专利(PCT/CN2006/000382)。DKK1用于癌症血清诊断的中国专利和国际专利均为本发明人首次在国内和国际上提出申请。