[发明专利]一种酶法制备高活性低分子量肝素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法制备高活性低分子量肝素的方法。属生物医药领域。

背景技术

肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之间，平均分子量为15000Da；肝素作为抗凝试剂和抗栓试剂已有60多年的历史。肝素的抗凝血活性主要通过含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心结合抗凝血酶(AT-Ⅲ)，诱导其发生构象改变，从而先是抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factor Xa)和抗凝活性(anti-factor Ⅱa)。抗凝血活性还和甘肃的分子量有关。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用会引起出血和诱导性血小板减少、骨质疏松等副作用，从而大大的限制了肝素在临床上的应用。此外，肝素肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等方面的生活功能。

低分子量肝素是由肝素通过化学法或酶法降解得到的小分子片段，分子量在3000-8000Da之间，平均分子量约为5000Da。低分子量肝素具有较高的抗栓活性，其抗凝活性则大大降低，表现出抗血栓形成时对凝血系统影响小，因而在临床中得到广泛的应用。与未分级肝素相比，低分子量肝素具有分子量小，按体重给药，药理学性质稳定，不需住院治疗，生物利用度高，副作用小，体内半衰期长等优点。

目前，LMWHs的制备方法(张万忠，王云山，马润宇，苏志国，生化药物杂志，2001，22(1)：48-51)主要有化学裂解法和酶降解法。化学降解法是工业上常采用的方法，主要有亚硝酸将揭发、β-消除降解法、过氧化氢降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是化学降解法肝素反应剧烈，使得肝素分子中的某些功能基团在反映过程中或多或少被破坏，因而某些生物活性功能在不同程度被破坏。而酶法降解由于反应条件温和、对环境友好，且便于检测，成为进年来的研究热点。美国专利(Nielsen，US5106734，1992)利用控制232nm处吸光值对肝素控制性降解，制备出分子量相对均以的低分子量产品。于广利等(于广利，王群，管华诗，徐家敏，Robert J，Linhardt，青岛海洋大学学报，2002，32(2)：231-235)利用肝素酶对牛肺肝素进行控制酶解，得到聚合度2-20的寡糖纯品。主要此外研究还表明，肝素的抗凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-，6-O-及3-O-位硫酸基参与结合AT-Ⅲ，与抗凝血活性有关，而2-O-位硫酸基和艾杜糖醛酸的作用尚不清楚(I.Capila，R.J.Linhardt，Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41：390-412.)。其中3-O-位硫酸基尤为重要：如果缺少3-O-位硫酸基，噶怒视的抗凝血活性则会降低1000倍以上；相反，增加一个3-O-位硫酸基，则可以将肝素的抗凝血活性提高数倍。肝素由多种生物合成酶在线粒体内合成。合成过程中会涉及多种合成酶，如：2-O-，6-O-，3-O-硫酸基转移酶(2-OST，6-OST，3-OST)分别对主链不同位置上的羟基进行部分硫酸化(U.Lindahl，M.Kusche-Gullberg，L.kJellen，J.Biol.Chem，1998，273：24979-24982.)，其中3-O-位硫酸化由3-OST完成。这些硫酸基转移酶大多具有多种异构型式，如3-OST就具有六种异构体。其中，3-OST-1和3-OST-5能合成肝素戊糖活性中心。现有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-OST-1和3-OST-5很好的底物(J.Chen，M.B.Duncan，K.Carrick et.，Glycobiology，2003，13：785-794)。因此，用3-OST-1和3-OST-5对低分子量肝素选择性修饰，使80％不具有戊糖活性中心的低分子量肝素经过反映后拥有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的数量，从而提高其抗凝血活性(理论上可以同时提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶法制备高抗凝血活性低分子量肝素的方法