[发明专利]梅山猪FUT1基因及其克隆和原核表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种梅山猪FUT1基因的克隆和原核表达方法，属于生物技术领域。 

背景技术

F18+肠毒素性大肠杆菌是引起仔猪腹泻和水肿病的主要病原，仔猪发病率为30％～40％，对养猪业造成巨大的危害。F18+大肠杆菌进入猪肠道后，依靠其菌毛黏附在肠上皮细胞表面，与猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘F18+受体结合，进而定居繁殖并产生肠毒素，通过渗透作用引发组织胺的释放, 导致血管壁损伤，水分大量渗出，从而引起水肿病和腹泻。F18肠毒素大肠杆菌能否致病直接取决于仔猪肠黏膜上皮细胞刷状缘有无与F18黏附素相应的受体（ETEC F18R）（ F18产肠毒素大肠杆菌） 。 

Vogeli等研究表明，α-1-岩藻糖转移酶基因（Fut1）是ETEC F18受体蛋白最佳候选基因，位于猪染色体6qll区段，开放阅读框(ORF)的长度为l 098 bp。该基因307位点存在多态性，该处碱基由G突变为A，从而失去一个Hin6 I酶切位点，这个突变也使得苏氨酸代替了丙氨酸，从而改变了蛋白质的构象和功能，导致了猪对ETEC F 18的敏感性差异，其中AA型为抗性基因型，GG和AG型为敏感性基因型。据此可以通过在猪的育种群体中对 FUT1 基因型的选择，来培育抗 E.coli F18（F18大肠杆菌）腹泻的品系。而晏学明等，施启顺等，包文斌等究了国内外部分猪种FUT1基因 M307 位点的多态性，均认为群体AA抗性型个体占少数且只出现在外来猪种中。这就充分表明国外猪种的F18大肠杆菌在抗性遗传基础与国内地方猪种存在着明显的差异，适用于国外猪种的通过筛选获得抗性基因型的育种方法并不能同样适合于中国地方猪种。 

发明内容

本发明的目的是提供一种梅山猪FUT1基因的克隆和原核表达方法，对梅山猪的FUT1基因进行基因克隆、原核表达，本发明获得了FUT1蛋白为体外菌毛粘附试验以及制备单克隆抗体提供了良好的实验基础。 

本发明的目的是保护一种梅山猪FUT1蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。 

本发明的另一目的是保护编码上述梅山猪FUT1蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。 

上述梅山猪FUT1蛋白基因的原核表达载体同时也是本发明的保护范围。 

梅山猪FUT1蛋白基因的原核表达载体的构建方法，具体包括如下步骤： 

（1）FUT1基因的克隆 

取猪的新鲜肺脏组织，提取总RNA，用反转录试剂盒反转录获得总cDNA；以cDNA为模板，以FUT1-EcoRI-F1和FUT1-SalI-R1为引物，进行PCR扩增，得扩增产物， 

所述FUT1-EcoRI-F1和FUT1-SalI-R1引物如下： 

FUT1-EcoRI-F1：5′-ggagaattcatgtgggtccccagcc-3′ 

FUT1-SalI-R1:5′-ccgtcgactcaaggcccagccaacatc-3′； 

（2）FUT1基因克隆载体的构建 

将步骤（1）所获得回收扩增产物和克隆载体pMD-18-T在T4连接酶的作用下，与16℃连接过夜，构建重组质粒pMD-18-T-FUT1，将重组质粒转化至感受态E.coli DH5a菌中，筛选阳性克隆，进行序列分析，筛选出序列定正确的阳性质粒，获得含有FUT1基因的pMD-18-T-FUT1重组质粒； 

（3）FUT1蛋白信号肽分析及去信号肽引物设计 

通过信号肽预测工具预测FUT1蛋白在1-11氨基酸存在信号肽；设计一对引物去除信号肽；上游引物FUT1-EcoRI-F2引入EcoRI酶切位点，下游引物FUT1-SalI-R2引入SalI酶切位点；上游引物FUT1-EcoRI-F2：5′ gcacggaattcatgctagtctgtgtt 3′；下游引物FUT1-SalI-R25′ caatgtcgactcaaggcccagccaacat 3′；目的片段大小1059b； 

（4）FUT1去信号肽基因的扩增