[发明专利]一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸扩增反应系统，尤其涉及一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

核酸等温扩增技术因其恒温的特性，而在核酸检测领域具有非常大的吸引力，例如环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）就是其中的典型代表。但是此类技术长期受制于气溶胶污染的问题，使其实际应用大受限制。LAMP比传统的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）灵敏得多，以致于它对痕量的污染也很敏感，经常出现假阳性。

目前已经有一些研究展示了用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）制备的微反应器去做LAMP反应，但PDMS这种材料的固有属性是多孔、透气，这些属性对于细胞培养等工作是有利的，但是却不适合核酸扩增的应用，因为在这个微反应器中会有溶液的蒸发及气泡的产生。实际上，引起气溶胶污染的最常见的原因是扩增过程中气泡的爆裂，而这类气溶胶很容易冲破PDMS微反应器的封合界面。此外，PDMS很疏水，基于PDMS的微加工往往在微观尺度上几何形状并不规则，这些都会导致在加样和加热的过程中产生气泡，这些气泡很可能会冲破对进样口、出样口或不同反应池之间所做的封闭。虽然有一些研究工作针对上述PDMS的缺点，对原始的PDMS进行了一些材料改性，意图提高它的不可渗透性及几何形状的规则性，但这无疑增加了制备的复杂性与成本。

在实际应用中以一种廉价、简单的装置高效地执行多种靶标的同时检测，依旧是一种紧迫的需求。有工作将传统的PCR小管小型化集成到一个PDMS芯片上去做多重扩增，但芯片的制作依然依赖于精密微加工。在最近几年，芯片上的液滴技术也被越来越多地用于核酸扩增，但是它们都需要复杂的流体控制系统，外设往往庞大且需要外部供电，因此从整体上来看，此类装置并没有真正地实现小型化。

为了避免复杂的流体控制，最近有些研究工作展示了一种基于毛细管的开放式芯片，其在物理化学上已被证明可以减低微尺度下被加热液体的快速蒸发，但它们要么依赖于复杂的微加工技术，要么减低蒸发的效果有限。在封闭体系下做无污染的核酸扩增依然占据主导地位，关键问题是如何实现一种简单但有效的封闭。

因此，本发明需要设计一种制作材料便宜，且简单有效封闭的微反应器进行核酸等温扩增。

发明内容

因此，本发明的目的是针对目前的核酸等温扩增系统操作复杂和制造成本高，无法实现真正的小型化，并且不能有效封闭，提供一种核酸等温扩增反应系统及其制备方法和应用，以达到核酸等温扩增操作简单，制造成本低，能够实现真正的小型化和有效封闭。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种核酸等温扩增反应系统，包括毛细管主体，所述毛细管主体中灌注有至少一个样品扩增反应液层，所述样品扩增反应液层的两端分别依次灌注有气体层和至少一个液体层。

优选地，所述液体层外还设有固体封闭层，优选地，所述固体密封层为环氧胶层。

优选地，所述液体层和固体密封层间还灌注有气体层。

优选地，当所述样品扩增反应液层为2个以上时，所述样品扩增反应液层间灌注有至少一个气体层。

优选地，所述样品扩增反应液层包含待检测核酸的模板、待检测核酸的引物、DNA聚合酶和反应缓冲液，更优选地，所述待检测核酸为DNA和/或RNA，进一步优选地，当待检测核酸的模板为RNA时，所述样品扩增反应液层还含有逆转录酶。

优选地，所述DNA为质粒。

优选地，所述RNA为从待检测样品中提取的RNA。

优选地，当所述样品扩增反应液层间灌注有2个气体层以上时，所述气体层通过液体层相间隔。

优选地，当所述液体层为2个以上时，所述液体层间通过气体层相间隔。

优选地，所述毛细管主体为玻璃毛细管主体。

优选地，所述气体层为空气层。

优选地，所述液体层为水层。

再一方面，本发明提供一种核酸等温扩增反应系统的制备方法，包括以下步骤：

1）通过移液枪将液体推入毛细管内，并继续将移液枪按至第二档，使得枪头里的气体也被注入管内；

2）然后按照步骤1）的操作依次加入至少一个样品扩增反应液和液体。

还一方面，本发明提供一种核酸等温扩增反应系统的制备方法，包括以下步骤：