[发明专利]只加入rmGM-CSF诱导BALB/c小鼠骨髓细胞分化为未成熟树突细胞的方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种诱导得到未成熟树突细胞的方法，具体是在只加入rmGM-CSF的情况下从BALB/c小鼠骨髓细胞成功诱导分化得到未成熟树突细胞的方法，意义在于在此基础上可以用原核表达纯化的钙网蛋白诱导其成熟，对树突细胞介导的肿瘤治疗具有潜在的应用价值。

背景技术

2011年度诺贝尔生理学或医学奖授予了三位免疫学家，其中加拿大人拉尔夫·斯坦曼(Ralph M.Steinman)对获得性免疫中树突细胞(dendritic cells，DC)的研究得到了首肯。1973年，斯坦曼等人首次从小鼠脾脏中分离出一类白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成类似神经细胞的树状突起，而命名为树突细胞。树突细胞在抗原俘获、加工和递呈过程中都发挥着关键性的作用，可辅助其他免疫细胞更好地发挥功能。树突细胞的发现及生理功能研究为许多疾病如癌症、AIDS、自身免疫性疾病等治疗带来了美好前景，斯坦曼也因此成为免疫学领域的科学大师之一。20世纪80年代，Inaba在体外成功地培养和扩增了小鼠树突细胞，90年代初，Caux和Banchereau诱导和扩增出了人树突细胞。

DC作为目前发现的抗原提呈功能最强的细胞，在免疫应答反应中起着举足轻重的作用。DC源于骨髓多潜能干细胞，从干细胞发育到祖细胞，再到前体细胞，最后进入血液循环，循环的DC通过血管细胞间隙进入组织后成为未成熟DC。它分布于全身的各脏器，在外周血中数量极少，仅占外周血白细胞数量的1％，但却发挥着至关重要的作用。实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型大脑中分离出大量表型为CD11b+CD11c+DC，能促进调节性T细胞的增殖，抑制免疫应答，突破了人们认为脑中没有DC分布的观点，使DC的分布范围扩展到了全身。DC有诸多亚群，其形态和功能各不相同，与其来源、成熟状态和组织定位等有关。DC按来源可分为髓系DC和浆系DC；按成熟状态可分为未成熟树突细胞(immatured dendritic cell，imDC)和成熟树突细胞(matured dendritic cell，mDC)；按组织定位则分为淋巴组织固有DC、外周组织DC和循环系统DC，其中，外周组织DC主要分布于皮肤和黏膜组织。皮内DC包括朗格汉斯细胞(Langerhans cell，LC)和真皮内DC。2007年发表于《科学》杂志的一项研究表明，DC和巨噬细胞具有共同的前体干细胞，这种干细胞能够分化为两类细胞，一类为巨噬细胞和DC前体细胞，分化为单核巨噬细胞和少量DC；另一类为普通DC前体细胞，最终分化为各种亚群的DC细胞。

肿瘤疫苗的研究长期以来一直是肿瘤特异性主动免疫治疗的主要研究方向，近年来，随着对肿瘤抗原摄取、加工、提呈以及T淋巴细胞活化机理等方面的认识不断深入，有关肿瘤疫苗的研究十分活跃，其中树突细胞瘤苗以其设计的合理性，应用的可操作性及显著的初步临床应用效果而备受瞩目。在1999年4月美国痛症年会上树突细胞瘤苗被认为是肿瘤治疗的一种最有希望的新技术。DC作为目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(APC)，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成，应用肿瘤相关抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，回输或免疫接种于载瘤宿主，通过MHC1抗原分子递呈给CD8+细胞毒性T细胞，从而诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应。DC根据其表面标记及抗原提呈功能分为未成熟DC及成熟DC。未成熟DC位于抗原入侵的部位，具有捕获、处理抗原的能力，但缺乏激活T细胞的能力。在种种刺激因子刺激下转化为具有抗原提呈功能，且表面表达共刺激分子的成熟DC。DC也是体内重要的免疫调节细胞，可通过分泌不同的细胞因子参与固有和适应性免疫应答。

因此，有效并且快速大量的诱导得到未成熟DC是树突细胞瘤苗的基础，本实验方法在只加入rmGM-CSF的情况下从BALB/c小鼠骨髓细胞就可以成功诱导分化得到未成熟树突细胞，方法简单易操作，得到的未成熟DC纯度高，并且可以在此基础上用原核表达纯化的钙网蛋白诱导其成熟，对树突细胞介导的肿瘤治疗具有潜在的应用价值。

经查，未发现只加入rmGM-CSF诱导BALB/c小鼠骨髓细胞分化为未成熟树突细胞的方法的报道。

发明内容

本发明的目的主要在于简单快捷地诱导出高产量高纯度的未成熟DC，为树突细胞介导的肿瘤治疗打下坚实的基础。