[发明专利]一种混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法。

背景技术

限制性内切酶是一种能识别特定核苷酸序列，并在特定位置水解双链DNA的内切酶。按照限制性内切酶在特殊核苷酸序列处进行切割时的切割方式，限制性内切酶可分为平末端限制性内切酶和粘性末端限制性内切酶。其中，平末端限制性内切酶在双链DNA的两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无粘性末端的平口，即平末端；而粘性末端限制性内切酶则是在双链DNA的两条链的特定序列的不同部位切割，形成粘性末端。因为平末端双链DNA进行连接时，其有两个不可回避的问题，其一是连接的非定向性，即DNA片段可以不同的方向连接，仅从连接形成的片段大小无法区分方向；其二是连接效率低，为了提高连接效率，往往通过提高底物的浓度来实现，但是浓度稍高则极易形成自连和多拷贝重复连接。而粘性末端双链DNA在进行连接时，既可保证DNA片段连接的方向性，连接效率也较平末端高。因此，在基因工程领域，粘性末端限制性内切酶得到了广泛的应用，而平末端限制性内切酶的应用则受到限制。

末端转移酶（Terminaltransferase，TdT）是一种无需模板的DNA聚合酶，它能催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。

现有技术中，一种构建T载体的方法包括，1）利用SmaⅠ或EcoRⅤ对质粒pUC57进行酶切，产生平末端酶切产物；2）利用末端转移酶和dTTP或ddTTP，在平末端酶切产物两端实现T的添加，从而获得T载体。该方法中，对质粒pUC57的酶切和对酶切产物3’羟基端的加尾是在两个不同的步骤中进行的，中间往往还需要对酶切产物进行纯化，步骤繁杂，实验效率低。另外，而在纯化过程中，因为回收效率的问题，会损失一部分的酶切产物，所以需要较大量的质粒pUC57进行酶切。此外，现有的构建与T载体相类似的载体的方法中，同样存在上述问题。

因此需要一种混合酶、酶切修饰试剂盒，利用该混合酶或酶切修饰试剂盒能同时实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，简化实验步骤，提高实验效率，并进一步降低对底物的需求量；还需要一种利用混合酶构建载体的方法，能同时实现对底物的酶切和酶切产物3’羟基端的延伸，简化实验步骤，提高实验效率，并能进一步降低对底物的需求量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种混合酶、酶切修饰试剂盒及构建载体的方法，旨在解决现有技术中实验步骤繁杂，实验效率低的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种混合酶，包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。

其中，所述末端转移酶可为野生型末端转移酶或重组型末端转移酶。

优选的，所述重组型末端转移酶为牛截短型末端转移酶，所述牛截短型末端转移酶与牛野生型末端转移酶相比，其N端被截去100至160个氨基酸。

上述任一方案中，所述平末端限制性内切酶可为AfeⅠ、AleⅠ、AluⅠ、BmgBⅠ、BsaBⅠ、BsrBⅠ、BstUⅠ、BstZ17Ⅰ、Cac8Ⅰ、CviKI-1、DpnⅠ、DraⅠ、Eco53KⅠ、EcoRⅤ、EcoRV-HF^TM、FspⅠ、HaeⅢ、HincⅡ、HpaⅠ、HpyCH4Ⅴ、MlyⅠ、MscⅠ、Ms1Ⅰ、MspA1Ⅰ、NaeⅠ、NlaⅣ、NruⅠ、PhoⅠ、PmeⅠ、Pm1Ⅰ、PshAⅠ、PsiⅠ、PvuⅡ、PvuⅡ-HF^TM、RsaⅠ、ScaⅠ、ScaⅠ-HF^TM、SfoⅠ、SmaⅠ、SnaBⅠ、SspⅠ、SspⅠ-HF、StuⅠ、SwaⅠ、XmnⅠ和ZraⅠ中的至少一种。

上述任一方案中，所述混合酶还可包括末端转移酶作用因子1。

本发明还提供了一种酶切修饰试剂盒，所述试剂盒包括混合酶；所述混合酶包括末端转移酶和平末端限制性内切酶。

其中，所述末端转移酶可为野生型末端转移酶或重组型末端转移酶。

优选的，所述重组型末端转移酶为牛截短型末端转移酶，所述牛截短型末端转移酶与牛野生型末端转移酶相比，其N端被截去100至160个氨基酸。