[发明专利]流感嗜血杆菌多重降落PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及流感嗜血杆菌感染的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落PCR检测方法在下呼吸道标本中流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）检测中的应用。

背景技术

流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎的主要病原菌，为苛养菌，其培养需V因子与X因子。主要引起肺炎与脑膜炎，每年造成约300万人严重患病并造成约38.6万人死亡。多数患者为5岁以下儿童。多数流感嗜血杆菌引起的死亡病例发生于发展中国家，这些国家尚未将流感嗜血杆菌疫苗纳入常规计划内免疫中（中国目前亦为计划外）。

成人发生侵袭性流感嗜血杆菌肺炎的危险因素有：免疫受损者、COPD、糖尿病、癌症、脾切除与慢性酒精中毒、金黄色葡萄球菌或甲型流感病毒引起的重症肺炎。

疫苗接种可预防由b型流感嗜血杆菌引起的侵袭性疾病的发生。发达国家由于疫苗的广泛接种，儿童流感嗜血杆菌肺炎已被消灭。但在未推广疫苗接种的国家，第年仍可造成数十万儿童死于流感嗜血杆菌感染引起的疾病。

Guma M.K.Abdeldaim等（Guma M.K.Abdeldaim,et al.,Detection of Haemophilus influenzae in respiratory secretions from pneumonia patients by quantitative real-time polymerase chain reaction.Diagn Microbiol Infect Dis,2009,64(4):366-373.）建立了以omp P6基因为靶标检测流感嗜血杆菌的实时定量PCR，然而他们发现该方法可将部分嗜血杆菌的其它菌种误鉴定为流感嗜血杆菌。同时针对流感嗜血杆菌的多个基因进行检测可提高检测方法的特异性。Korbie,D.J.等（Korbie,D.J.and J.S.Mattick,Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification.Nat.Protocols,2008.3(9):p.1452-1456.）发现降落PCR可提高PCR的特异性与灵敏度。当前尚无同时针对流感嗜血杆菌omp P6、frdB、16S rRNA基因以检测流感嗜血杆菌的多重PCR报道。本发明建立的多重降落PCR可直接检测下呼吸道标本中的流感嗜血杆菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于流感嗜血杆菌感染的快速诊断与流行病学调查。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测下呼吸道标本中流感嗜血杆菌的多重PCR检测试剂盒及检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术发案实现的：

一种流感嗜血杆菌多重降落PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，流感嗜血杆菌阳性对照DNA，3对流感嗜血杆菌引物；

第1对：5’-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’（SEQ ID NO.1）与5’-TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’（SEQ ID NO.2）；

第2对：5’-CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’（SEQ ID NO.3）与5’-CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’（SEQ ID NO.4）；

第3对：5’-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3’（SEQ ID NO.5）（Hendolin PH,et al.Use of multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterial species in middle ear effusions.J Clin Microbiol,1997,35(11):2854-2858.）与5’-AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3’（SEQ IDNO.6）；

本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法：

（一）提取待检样本DNA

（二）多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的omp P6、frdB、16S rRNA基因，具体步骤如下：

3对流感嗜血杆菌引物为：

Hi_omp P6-F：5’-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’（SEQ ID NO.1）