[发明专利]利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法及其专用双链RNA有效
申请号: | 201210147283.3 | 申请日: | 2012-05-14 |
公开(公告)号: | CN102703448A | 公开(公告)日: | 2012-10-03 |
发明(设计)人: | 赵传志;王兴军;李爱芹;毕玉平;夏晗;李长生;孟昭东 | 申请(专利权)人: | 山东省农业科学院高新技术研究中心 |
主分类号: | C12N15/113 | 分类号: | C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00 |
代理公司: | 济南诚智商标专利事务所有限公司 37105 | 代理人: | 韩百翠 |
地址: | 250100 山东*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 利用 人工 microrna 培育 抗粗缩病 玉米 方法 及其 专用 rna | ||
1.一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的专用双链RNA,其特征是,它是由sequenceA和sequenceB组成的双链RNA;所述sequenceA如SEQ NO.1-34所述;所述sequenceB的核苷酸序列是与sequenceA反向互补,或者与sequenceA小于4个碱基错配的反向互补序列。
2.一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法,其特征是,首先克隆玉米内源的microRNA,然后以玉米内源的microRNA为模板,以分别含有如权利要求1所述的sequenceA和sequenceB的一对引物进行PCR扩增,将扩增后的序列通过酶切,连接转化到带有ubiqutin或者CaMV 35S启动子的植物表达载体中;或者通过人工合成的方式,直接合成带有权利要求1所述的sequenceA和sequenceB的人工microRNA前体序列,然后连接转化到带有ubiqutin或者CaMV 35S启动子的植物表达载体中;然后将该植物表达载体通过农杆菌侵染或者基因枪的方法导入玉米中,得到抗玉米粗缩病的转基因玉米。
3.如权利要求2所述的一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法,其特征是,所述玉米内源的microRNA为zma-MIR159a,所述扩增用的引物为primer 7:TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG,和primer 8:CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG;PCR反应程序为94℃ 5min;再94℃ 50s,54℃ 45s,72℃ 1min,30循环;72℃ 7min。
4.如权利要求2或3所述的一种利用人工microRNA培育抗粗缩病玉米的方法,其特征是,所述克隆zma-MIR159a的方法是,以玉米总RNA为模板,反转录成cDNA;然后以primer1:5’-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3’,primer2:5’-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’进行PCR反应,PCR反应程序为94℃ 5min;再94℃ 50s,54℃ 45s,72℃ 1min,30循环;72℃ 7min;以扩增后的稀释产物为模板,以primer3:5-’TCGATGCTTTGGGTTTGA-3’,primer4:5’-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’,以同样的程序进行第二轮扩增,或者不进行第一轮扩增,直接用primer3和primer4进行第二轮扩增。
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