[发明专利]高产香紫苏醇菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及高产香紫苏醇菌株的构建方法。更具体的说，本发明涉及真核微生物生产香紫苏醇的方法。

背景技术

异戊二烯类(isoprenoids)化合物，也称萜烯或萜类化合物，是一类自然界中广泛存在的种类最多的化合物，已有40,000多种不同的萜类化合物从植物、动物及微生物中分离出来(Rohdich et al.，2005，Biochem Soc Trans.33：785-791)。这类化合物丰富多样的结构为解决人类健康和社会问题提供了良好的化合物筛选库，并且一些化合物已广泛用于医药、保健食品、香料、农用化学品等(Misawa，2011，Curr Opin Biotechnol.22：627-633)。然而，这类化合物在天然宿主中的产量极少，很大程度上限制了该类化合物的工业生产及应用。目前，解决该困难的有效方法之一，是通过合成生物学及途径工程手段对异源微生物或植物的代谢途径进行重组改造，引入目标产物合成的关键基因，通过途径优化等策略异源合成目标产物。该生物方法具有生产工艺简单、周期短、对环境友好、不依赖于土地及气候因素的优点。目前，已有很多成功的实例，其中最具代表性的当属青蒿素前体青蒿酸(Martin et al.，2003，Nat Biotechnol.21：796-802)、紫杉醇前体紫杉二烯(Ajikumar et al.，2010，Science.330：70-74)和番茄红素(Alper et al.，2005，Nat Biotechnol.23：612-616)。

香紫苏醇(sclareol)又称硬尾醇，是一种半日花烷(labdane)型二萜二叔醇，是植物的次级代谢产物，最初在鼠尾草属唇形香料植物香紫苏(Salvia sclarea)中提取，并由此得名，其最丰富的来源是香紫苏的头状花序及烟草(Nicotiana glutinosa)的叶子。香紫苏醇常用于化妆品和香水的香味材料以及食品的调味材料，并且在医药和农药上具有重要的生物活性。如香紫苏醇具有很强的抗菌活性以及在真菌生长调节和植物生长抑制方面起作用，并且对人类的白血病细胞(Dimas et al.，1999，Leuk Res.23：217-234)、肿瘤细胞株(Mahaira et al.，2011，Eur J Pharmacol.666：173-182)、结肠癌细胞及异种移植物(Dimas et al.，2007，Apoptosis.12：685-694；Mahaira et al.，2011，Eur J Pharmacol.666：173-182)具有细胞毒性。

目前，香紫苏醇的生产大多以植物香紫苏花序及茎叶提油后的香紫苏浸膏为原料，缺点是植物香紫苏的生长周期长，且受限于土地、环境及气候因素的影响，不能完全满足工业化生产的需求。2009年，瑞士日内瓦弗门尼舍有限公司的Schalk克隆出植物香紫苏中香紫苏醇合成的两个关键基因，一是，焦磷酸赖百当烯二醇酯(labdenediol diphosphate，LPP)合酶(SsLPPs，II型萜类合酶)，催化二萜类化合物前体物质GGPP生成LPP；二是，香紫苏醇合酶(SsTps，I型萜类合酶)，催化LPP生成香紫苏醇，在E.coli中过表达两酶，可胞内生成香紫苏醇(WO.Pat.NO.2009101126-A1)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产香紫苏醇基因工程菌株的构建方法，并且利用该菌株大量生产香紫苏醇。相对于从植物中提取，微生物培养法能够有效降低成本，节省消耗在植物培养上的时间及土地。

高产香紫苏醇菌株的构建方法增加宿主香紫苏醇合成的前体物质——双牻牛基焦磷酸(GGPP)，进而使更多的GGPP流向香紫苏醇的合成过程；

所述宿主为酿酒酵母。

所述酿酒酵母工程菌株构建过程如下：

1)将香紫苏醇合成关键酶基因在酿酒酵母中表达；进而使更多的GGPP流向香紫苏醇的合成过程；

关键酶基因为：焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶基因(LPPs)和香紫苏醇合酶基因(Tps)；

2)将GGPP合成的相关酶基因在酿酒酵母中过表达；进而增加宿主香紫苏醇合成的前体物质；

相关酶基因为：羟甲基辅酶A还原酶基因(HMG1)、法尼基焦磷酸合酶基因(ERG20)和双牻牛基焦磷酸合酶基因(BTS1)中的一个或二个以上酶基因的组合。