[发明专利]一类对pH变化敏感的罗丹明荧光探针、合成方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类对pH变化敏感的罗丹明荧光探针。

背景技术

罗丹明是一类广泛应用于生物传感与材料科学的一类荧光分子，由于其较大的摩尔吸光系数，较高的荧光量子产率，较长的吸收和发射波长,使其广泛用做激光染料、生物标记试剂以及设计荧光增强型探针。罗丹明存在的形式有无色的罗环内酯和紫色两性离子，通常在急性质子行溶剂中存在的形式是深红色的两性离子。其中很多以罗丹明的内酰亚胺形式设计的金属离子探针，通过罗丹明开环的荧光和关环的无荧光来对金属离子进行响应。

与荧光素相比，罗丹明具有较好的光稳定性、较宽的光谱可调范围（500-680 nm），尽管罗丹明具有较好的光物理光化学性质，但是罗丹明的一个显著特征是对pH不敏感，很难应用于对pH的检测。为此人们通过对罗丹明结构进行修饰，设计合成了许多罗丹明螺内酰胺类衍生物。这些罗丹明衍生物弥补了罗丹明在pH不敏感方面的缺陷，使其能够监测pH的变化。但是这些结构的修饰改变了罗丹明的水溶性，使其不利于对活的生物样品的pH进行监测。为此，急需开发具有良好水溶性、并具有对pH敏感的罗丹明荧光探针。

发明内容

本发明提供了一类对pH变化敏感的罗丹明荧光探针及其制备方法。

一类罗丹明荧光分子，该荧光分子具有如下结构（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）、（IV）通式中的一种：

其中，R可以是氢原子、甲基、乙基、丙基、异丙基。X可以是氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根离子、磷酸根离子、高氯酸根离子或氟硼酸根离子。

以实例一和实例二为例该罗丹明类荧光分子的合成方法按如下步骤进行：

a、将二溴荧光素溶于无水甲苯中，加入四倍量的N-甲基哌嗪，20%的醋酸钯，20%BINAP，加热回流20小时，将反应液减压蒸干，柱分离得目标产物。

b、将上述所得内盐产物溶于甲醇中，滴加2倍量浓盐酸搅拌1h，将甲醇旋干提纯得紫色固体。

c、将上述b所得产物溶于甲醇中，滴加2倍量二氯亚砜升温回流反应，冷却将甲醇旋干提纯得紫色粉末固体。

实例一和实例二为例上述罗丹明类荧光分子的制备反应式如下：

与传统罗丹明不同,本发明的罗丹明荧光分子比传统罗丹明环上多两个N原子，母体环上含有四个N原子，，可通过N原子的PET效应控制使其对H⁺有灵敏的响应，同时具有良好的水溶性，且由于罗丹明母体环上胺基的不同使得本发明的罗丹明荧光分子具有不同pKa值，同时由于其具有较强结合氢离子的能力使得本发明的罗丹明荧光分子具有细胞定位作用，同时可检测细胞微环境的pH值。

本发明的罗丹明荧光分子的激发波长在450-480 nm和500-540nm范围内，水溶性好，化学稳定性好；荧光分子合成简单，通过改变反应物胺的种类来实现对罗丹明分子的修饰。用于化学环境中pH的检测，具有不同的pKa值。引入的胺可以使荧光分子对pH具有灵敏响应，并具有较高的灵敏度；通过选用不同类型的胺使得合成的罗丹明荧光探针具有不同的pKa值。同时由于本发明的罗丹明荧光探针具有很强的结合氢离子的能力，使得其对细胞具有定位作用，可应用于细胞微环境pH的检测。

本发明的合成了一系列新型罗丹明类荧光分子，通过改变罗丹明环上胺基来实现罗丹明分子对pH的响应，其合成步骤简单，同时具有较宽的发射波长 （520 nm和565nm）可以避免细胞或组织的自发荧光的干扰，提高成像深度，减少对生物组织的光损伤；本发明中荧光分子的设计机理是通过改变罗丹明环上的胺来实现合成具有不同pKa值的罗丹明荧光分子，从而实现不同pH的检测，同时通过引入多个N原子来增强结合氢离子的能力，使其具有不同pKa值。

附图说明

图1是本发明的实例施1中不同pH值下的吸收变化曲线图。

图2是本发明的实例施1不同pH值下的荧光变化曲线图。

图3是本发明的实例施554nm处 不同pH值下的荧光强度变化图。

具体实施方式

实施例1

a、将二溴荧光素溶于无水甲苯中，加入四倍量的N-甲基哌嗪，20%的醋酸钯，20%BINAP，加热回流20小时，将反应液减压蒸干，柱分离得目标产物，产率60%，HRMS(M⁺) 496.25

b、将上述所得内盐产物溶于甲醇中，滴加2倍量浓盐酸搅拌1h，将甲醇旋干提纯得紫色固体。

实例2