[发明专利]靶向上调PAR-4基因小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及靶向上调PAR-4基因的小激活RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用。

背景技术

2006 年Li等报道靶向基因启动子区的dsRNA(双链RNA,double-stranded RNA)能引起序列特异性的基因转录激活，并把此现象命名为RNA引起的基因激活(RNA activation,RNAa)，而把这样的dsRNA称为小激活RNAs (small activating RNAS,saRNAs)。RNA激活基因表达是哺乳动物细胞中的普遍现象，其机制可能是短双链RNA与目的基因的反义转录产物结合，对启动子区进行表观遗传学修饰（组蛋白乙酰化、去甲基化等），进一步募集转录因子到基因的启动子区，从而增强目的基因的表达。

人PAR-4基因首次被发现于外源性因素诱导的凋亡的前列腺癌细胞中。许多研究证明PAR-4的功能是各种细胞凋亡途径所必需的，过量异位表达的PAR-4足以诱导大多数肿瘤细胞发生凋亡，但不会导致正常或永生化细胞的凋亡。PAR-4能通过激活Fas死亡受体信号转导通路和抑制NF-kB，从而保证肿瘤细胞内caspase级联反应的发生不受干扰。更重要的是，无论是皮下异位还是原位的前列腺癌小鼠模型，瘤内注射能过量表达PAR-4的腺病毒，均能导致肿瘤凋亡和生长抑制。因此，PAR-4蛋白的表达增高具有显著的肿瘤治疗前景，是saRNAs理想的靶基因。

发明内容  

本发明的目的是提供一种靶向上调PAR-4基因的小RNA在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明包含多种序列的saRNA，这些小RNA能够通过靶向上调膀胱癌细胞中PAR-4基因的表达，抑制肿瘤细胞活力、诱导细胞凋亡，进而可以应用于抗膀胱癌药物的制备。

所述靶向上调PAR-4基因的小RNA的核苷酸序列为3对（6条）21个核苷酸的正义链和反义链组成。其序列分别为：dsPAR-4-433 S（SEQ ID NO:1）：5’-AAU ACG GUC UUG UAC UUA A[dT][dT] -3’， dsPAR-4-433 AS（SEQ ID NO:2）：5’-UUA AGU ACA AGA CCG UAU U[dT][dT] -3’； dsPAR-4-434 S（SEQ ID NO:3）：5’-UAA UAC GGU CUU GUA CUU A[dT][dT] -3’， dsPAR-4-434 AS（SEQ ID NO:4）：5’-UAA GUA CAA GAC CGU AUU A[dT][dT] -3’； dsPAR-4-435 S（SEQ ID NO:5）：5’-AUA AUA CGG UCU UGU ACU U[dT][dT] -3’，dsPAR-4-435 AS（SEQ ID NO:6）：5’-AAG UAC AAG ACC GUA UUA U[dT][dT] -3’。每条链的3’端均悬挂突出两个核苷酸（通常为dTdT，中间19个核苷酸配对）。

本发明制备saRNA操作简单，成本较低，用量较少，50nM的转染浓度即可达到良好的激活效果；激活作用确切，靶基因mRNA和蛋白水平均有升高。另外saRNA诱导基因表达属于表观遗传学调节，不破坏基因组的完整性，因此应用较为安全。

附图说明

图1是不同位点dsRNAs对T24细胞内PAR-4 mRNA表达的影响，GAPDH表达量作为内参。

图2是不同位点dsRNAs对T24细胞内PAR-4 mRNA表达的影响程度，数据为PAR-4/GAPDH比值，来源于3次独立实验的平均值。

图3是dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达，β-actin表达量作为内参。

图4是dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达，数据为PAR-4/β-actin比值，来源于3次独立实验的平均值。

图5是dsPAR-4-435上调T24细胞内PAR-4蛋白的表达呈浓度依赖性，β-actin表达量作为内参。

图6是dsPAR-4-435上调5637细胞内PAR-4蛋白的表达，β-actin表达量作为内参。

图7是dsPAR-4-435上调5637细胞内PAR-4蛋白的表达，数据为PAR-4/β-actin比值，来源于3次独立实验的平均值。

图8是dsPAR-4-435抑制T24细胞的生长，细胞图像由Olympus倒置相差显微镜在放大100倍情况下拍摄。

图9是dsPAR-4-435抑制5637细胞的生长，细胞图像由Olympus倒置相差显微镜在放大100倍情况下拍摄。